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流行性造血器官壞死病毒(EHNV)熒光 PCR 檢測試劑盒技術(shù)參數(shù)

閱讀:209          發(fā)布時間:2020-5-22
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流行性造血器官壞死病毒(EHNV)熒光 PCR 檢測試劑盒說明書

 

     

1.試劑盒簡介貨

流行性造血器官壞死病毒(EHNV)熒光 PCR 檢測試劑盒主要感染當(dāng)年草魚種和青魚,死亡率可達80%以上。其它淡水鯉科魚,如鰱魚、鳙魚、鯽魚、鯉魚感染后沒有臨床癥狀,但可以攜帶病毒到處傳播。該病在水溫高于20℃以上時流行, 25~28℃為流行高峰。常見的臨床癥狀為眼突出、體色發(fā)黑,口腔、鰓蓋和鰭條基部出血。撕開表皮,可見肌肉出現(xiàn)點狀或塊狀出血。剖檢腹腔, 可見腸道充血, 肝、脾充血或因失血而發(fā)白。病原為草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV),是水生呼腸孤病毒屬(Aquareovirus)的成員。病毒為直徑70nm的球形顆粒,有雙層衣殼,無囊膜,含有11個片段的雙鏈RNA。根據(jù)片段長度大小分為大(L1、L2、L3,大小在4.0kb~3.7kb)、中(M4、M5、M6,大小在2.5~2.0kb)、?。⊿7、S8、S9、S10、S11, 大小在1.6~1.0kb) 三組。在不同地區(qū)存在抗原性、核酸電泳圖譜、對細胞的敏感性和對魚的毒力都有一定差異的毒株。多年研究已經(jīng)確定的有二個典型的代表株:GCRV-873為湖南株,能在CO、CIK等細胞中大量增殖并出現(xiàn)CPE,癥狀以內(nèi)臟出血為主;GCRV-9014為湖北株,能在CIK、CO細胞中大量增殖,但不產(chǎn)生CPE,癥狀以肌肉出血為主。在核酸序列上GCRV-9014株和GCRV-873株的同源性不到81%。為了適應(yīng)草魚出血?。℅CRV)快速檢測和疫病研究的需要,本公司嚴格依據(jù)SN/T3584-2013草血病檢疫技術(shù)規(guī)范規(guī)定的檢測GCRV-9014株病毒的引物序列及其循環(huán)參數(shù)等技術(shù)標(biāo)準(zhǔn),在本公司嚴謹?shù)漠a(chǎn)品質(zhì)量保證體系管控下和質(zhì)檢。確保本試劑盒滿足標(biāo)準(zhǔn)的檢測要求。本試劑盒具有快速靈敏、特異、準(zhǔn)確、安全、操作簡單、應(yīng)用廣泛等特點及優(yōu)點。

2、試劑盒組成

試劑盒組成包括核酸擴增試劑。具體組成參見表 1:

表 1:試劑盒組成(50test/盒)

試劑盒組成成分 體積

核酸提取試劑: 核酸裂解液 15ml×2 管

核酸擴增試劑: DEPC 水

GCRV-9014 RT-PCR 反應(yīng)液

酶混合物陰性對照

GCRV-9014 陽性對照 1ml×1 管

750µL×1 管

60µL×1 管

1ml×1 管

1ml×1 管

(注:核酸提取試劑可使用本公司的提取核酸更快捷方便的《病毒 RNA 柱式提取試劑盒》)

3、樣本采集,存放及運輸

3.1流行性造血器官壞死病毒(EHNV)熒光 PCR 檢測試劑盒樣本采集:所用取樣器材必須經(jīng)高壓滅菌并烘干。

取新鮮魚類組織臟器(肝、腦、脾、腎)2g 于已洗凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨,加 5ml PBS 混勻,2 000r/min 離心 10min 取上清轉(zhuǎn)入無菌離心管中備用?;蛉∮锌梢杉毎∽兊募毎麘乙河糜跈z測。

3.2存放:研磨后的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h;-70 ℃以下可長期保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融(多凍融 3 次)。

3.3運輸:采用冰或泡沫箱加冰密封進行運輸。

 

4、一步法 RT-PCR 檢測

 

4.1操作方法

 

4.1.1樣本的處理(在樣本制備區(qū)進行):

4.1.1.1取 n 個滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管,其中 n 為被檢樣品與陰性對照的和(陽性對照、陰性對照在試劑盒中已標(biāo)出),做標(biāo)記。(注:試劑盒中的陽性對照直接作為 PCR 檢測的模板,無需提取核酸)

4.1.1.2每管加入 600 ?L 裂解液,分別加入被檢樣本和陰性對照各 200 ?L,一份樣本換用一個吸頭,再加入 200 ?L 氯,混勻器上振蕩混勻 5 s(不能過于強烈,以免產(chǎn)生乳化層,也可以用手顛倒混勻),于 4℃ 12 000 r/min 離心 15 min。

4.1.1.3取與 4.1.1.1 相同數(shù)量滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管,加入 500 ?L 異丙醇(-20℃預(yù)冷), 做標(biāo)記。吸取 4.1.1.2 各管中的上清液轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中,上清液應(yīng)至少吸取 500?L,不能吸出中間層,顛倒混勻。

4.1.1.4于 4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min(Eppendorf 管開口保持朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置),小心倒去上清,倒置于吸水紙上,沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干);加入 600 ?L 75% 乙醇,顛倒洗滌。

4.1.1.5于 4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min(Eppendorf 管開口保持朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置),小心倒去上清,倒置于吸水紙上,盡量沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)。

4.1.1.64 000 r/min 離心 10s(Eppendorf 管開口保持朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置),將管壁上的殘余液體甩到管底部,小心倒去上清,用微量加樣器將其吸干,一份樣本換用一個吸頭,吸頭不要碰到有沉淀一面,室溫干燥 3 min,不能過于干燥,以免 RNA 不溶。

4.1.1.7加入 11 ?L DEPC 水,輕輕混勻,溶解管壁上的 RNA,2 000 r/min 離心 5 s,冰上保存?zhèn)溆?。提取?RNA 須在 2 h 內(nèi)進行 PCR 擴增;若需長期保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)。

【也可參照《病毒 RNA 柱式提取試劑盒說明書》(貨號:HB-QPCR-01)使用,更方便快捷提取核酸】。

注:提取的 RNA 須在 2 h 內(nèi)進行 PCR 擴增;若需長期保存須放置-70 ℃冰箱內(nèi)。

 

4.2、試劑準(zhǔn)備

 

4.2.1擴增試劑準(zhǔn)備(在反應(yīng)混合物配制區(qū)進行):

從試劑盒中取出相應(yīng)的一步法RT-PCR反應(yīng)液、RT-PCR混合酶,在室溫下融化后,2 000 r/min 離心5 s。設(shè)所需一步法RT-PCR檢測總數(shù)為n,其中n為被檢樣品、陽性對照與陰性對照的和,每個樣品測試反應(yīng)體系配制見下表2。

表 2 每個樣品測試反應(yīng)體系配制表

試劑 RT-PCR 反應(yīng)液 RT-PCR 混合酶

用量 15 μL 1.0 μL

根據(jù)測試樣品的數(shù)量計算好各試劑的使用量,加入到適當(dāng)體積試管中,充分混合均勻,向每個一步法RT-PCR管中各分裝15 μL,轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。

4.2.2加樣(在樣本處理區(qū)進行):

在各設(shè)定的一步法RT-PCR管中分別加入上述樣本處理步驟4.1.1.7中制備的RNA溶液各10μL,蓋緊管蓋,500 r/min離心30s。

4.3、流行性造血器官壞死病毒(EHNV)熒光 PCR 檢測試劑盒檢測(在檢測區(qū)進行):

將4.2.2中離心后的PCR管放入PCR檢測儀內(nèi),記錄樣本擺放順序。循環(huán)條件設(shè)置如下: 一階段:42 oC/30 min;

第二階段:94 oC/4 min;

第三階段:94 oC/1 min, 55 oC/1 min,72 oC/1 min, 30個循環(huán); 第四階段,72 oC/8 min;

第五階段,4 oC 保存。

4.4、瓊脂糖電泳

 

用電泳緩沖液制備1.5%的瓊脂糖凝膠平板。將平板放入水平電泳槽,使電泳緩沖液剛好淹沒膠面。將10μL樣品PCR擴增產(chǎn)物和相應(yīng)電泳上樣緩沖液(Loading Buffer)按比例混勻后加入樣品孔。在電泳時設(shè)立DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量作對照。5 V/cm電泳約0.5 h,當(dāng)溴酚藍到達底部時停止。在紫外燈下或凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴增初預(yù)期的特異性DNA電泳帶,拍攝并記錄。

5、結(jié)果判定

 

5.1一步法RT-PCR后陽性對照出現(xiàn)一條320bp的DNA段。陰性對照和空白對照沒有該核酸帶。

5.2待測樣品在相應(yīng) 320 bp DNA 位置上有帶,可判陽性。

 

6、相關(guān)技術(shù)信息

 

F: 5’-acgtg cgatt ggaag agctt- 3’ R: 5’-agttc tcaaa gctga gacag- 3’

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