科研ELISA實(shí)驗(yàn)中會遇到很多問題，不是這有點(diǎn)小問題，就是那有點(diǎn)小問題。以下七點(diǎn)是我們在多年的實(shí)驗(yàn)過程中遇到問題的總結(jié)：

1、標(biāo)曲不顯色或顯色很弱，樣本顯色

溶解標(biāo)準(zhǔn)品以及倍比稀釋時，未渦旋震蕩或不夠充分。標(biāo)準(zhǔn)品溶解、倍比稀釋時均需要渦旋震蕩以保證充分混勻。單純依靠移液器反復(fù)吹打，效率較低、效果也不一定最佳。

2、標(biāo)曲和樣本均不顯色

在孵育階段靜置在桌面上，這樣非常不利于抗原抗體之間的充分接觸，導(dǎo)致顯色偏弱，推薦孵育階段，使用ELISA專用的微孔板振蕩器，調(diào)至合適的頻率，使抗原抗體充分接觸，保證結(jié)合效果。如果排除上述原因，有可能是漏加了某個組分，如檢測抗體、酶等。對于比較馬虎的新手，一定要做好標(biāo)記和記錄，或者使用添加染料的ELISA試劑盒。

3、標(biāo)曲顯色，樣本不顯色

當(dāng)樣本中目的蛋白濃度極低或者樣本中干擾因素較強(qiáng)，就無法檢測到。目前ELISA仍然是蛋白檢測靈敏度的方法，與不同技術(shù)結(jié)合后，衍生出了多種類型的ELISA，提高了檢測靈敏度。

對于目的蛋白濃度特別低的樣本，可以嘗試用高敏ELISA，但這也并不意味著一定能檢測到樣本濃度，只能說可以提高樣本的可測率，并使結(jié)果更加可靠。因?yàn)橥ǔＳ闷胀‥LISA檢測的樣本OD值都偏低，而高敏ELISA可提高樣本OD值，使之盡量位于標(biāo)曲范圍內(nèi)，得到的數(shù)值也更加可信。

4、標(biāo)曲和樣本都顯色，但復(fù)孔的CV大

這個問題就跟移液器和實(shí)驗(yàn)者的操作有關(guān)了。移液器的使用維護(hù)不規(guī)范，就會造成移液的誤差較大；實(shí)驗(yàn)者自身的操作習(xí)慣、加樣的一致性對復(fù)孔的CV也有很大影響。

掌握移液器的正確使用和維護(hù)。關(guān)于個人的操作可練習(xí)移液動作、加快速度，確保移液的精密度。

5、本底偏高，樣本值測不到

標(biāo)曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(對于高敏ELISA可以適當(dāng)放寬要求)。尤其是樣本值特別低的時候，本底過高會掩蓋目的信號，導(dǎo)致無法測到樣本值。

在加入TMB顯色后，需實(shí)時觀察標(biāo)曲顯色情況。通常在S5孔有肉眼可見的微弱藍(lán)色，即可終止反應(yīng)。

6、樣本經(jīng)不同梯度稀釋，計(jì)算得到的樣本值差異較大

有時候我們不清楚樣本中目的蛋白的濃度如何，應(yīng)該如何稀釋，那么我們就會做下預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定稀釋倍數(shù)。然而有時候同一樣本做了幾個不同梯度稀釋后，計(jì)算得到的樣本值之間差異較大，應(yīng)該選擇哪一個稀釋倍數(shù)呢？

這里涉及到了基質(zhì)效應(yīng)。通常血清樣本加樣量較高時，血清中的各種蛋白會抑制抗原抗體的接觸，基質(zhì)效應(yīng)較明顯。而經(jīng)過稀釋后，干擾因素也隨之稀釋，影響就會較小。當(dāng)某兩個梯度稀釋后，計(jì)算得到的樣本值接近時，我們就可以認(rèn)為在該稀釋梯度時，樣本中的干擾因素影響較小，計(jì)算得到的值也是接近真實(shí)的。然而這樣的稀釋是針對目的蛋白濃度較高的樣本而言。對于濃度很低的樣本，經(jīng)過多倍稀釋后，就更加測不到了，此時可按照說明書推薦的加樣方式操作。

7、不同試劑盒中的組分能否通用

除非是公用的試劑如洗液、檢測緩沖液，其它組分不建議用其它試劑盒的組分，甚至是同一指標(biāo)不同批次的試劑盒里的組分。這些組分(包括標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液、檢測抗體、酶等)都是經(jīng)過優(yōu)化的，如果貿(mào)然使用其它試劑盒的組分，有可能對結(jié)果產(chǎn)生影響。