菌種的復蘇與保存應在超凈工作臺或生物安全柜內進行。

一、菌種的復蘇

把凍干菌種管、滅菌1mL滴管、雙碟、鑷子、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂斜面數支，移入超凈工作臺或生物安全柜。

先用砂輪將凍干菌種安瓶頸部挫出刻痕，再將凍干菌種管外壁用dian酒擦洗消毒、稍干，用75%乙醇棉擦凈，放在滅菌雙碟內，待干。點燃酒精燈，將菌種管的封口一端在火焰上，燒灼紅熱，用滅菌滴管吸取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，滴在灼熱的菌種管封口一端，使驟冷而炸裂。

取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口打開，放入滅菌雙碟內，另取1支滅菌滴管，在火焰旁吸取營養(yǎng)肉湯少許，加至菌種管底部，將凍干菌攪動促使溶解，隨即吸出管內菌液，分別接種至營養(yǎng)瓊脂斜面及普通肉湯內，并將滴管及菌種管投入消毒液內，將已接種的營養(yǎng)肉湯及營養(yǎng)瓊脂斜面置35~37℃培養(yǎng)22~24h。

取出培養(yǎng)物，仔細觀察菌苔形態(tài)、有無雜菌、涂片、革蘭氏染色鏡檢，呈典型菌落后，轉種3代即可應用。如發(fā)現(xiàn)菌型不典型，可進行平板分離單菌落。

二、菌種的傳代與保存

1：菌斜面（保存）

培養(yǎng)基應新鮮制備，如斜面已無冷凝水者，不宜再使用。標簽上注明菌名及接種日期。

至冰箱取出的菌種斜面，應在室溫放置約30分鐘，待溫度平衡后再移入接種室或超凈工作臺。

點燃酒精燈，用左手握住菌種斜面，將管口靠進火焰旁，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅30秒，隨后將全部接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過3次。左手將管口在火焰上旋轉燒灼，右手用無名指、小指及掌部夾住棉塞，撥開棉塞，將接種環(huán)伸人管內先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷卻再移至菌苔上，刮去少量菌苔，隨即取出接種棒，并將菌種管口移至火焰旁。

堵上棉塞，左手將菌種管放下，取營養(yǎng)瓊脂斜面1支，照上述操作打開棉塞，將接種環(huán)伸入管內至瓊脂斜面的低部，由底向上，將接種環(huán)輕貼斜面的表面曲折移動，使細菌劃在斜面的表面上。

取出接種棒，在火焰旁將培養(yǎng)基管棉塞堵上，然后將接種過細菌的接種棒在火焰上燒灼滅菌。

將已接種畢的細菌管置35~37℃培養(yǎng)22~24小時，霉菌管一般置20~25℃霉菌培養(yǎng)箱內培養(yǎng)7日。取出后放人冰箱保存，一般 3個月轉種一次。

2：菌斜面-營養(yǎng)肉湯-分離平板-菌斜面

如果菌落形態(tài)不典型可純化，按下列方法傳代（分離菌落）：用接種環(huán)取上述菌管（斜面）菌苔少許接種置營養(yǎng)肉湯中(5mL/支，已滅菌)，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時后，再用接種環(huán)取培養(yǎng)好的營養(yǎng)肉湯菌懸液（濃菌液），接種于分離平板，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時，用接種針選典型菌落劃線于營養(yǎng)瓊脂斜面，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時。一般同時接種幾支管，其中一支用于以后菌種傳代或接種到半固體瓊脂培養(yǎng)基中，其它用做工作菌種。

常用分離平板包括：大腸埃希菌——EMB瓊脂平板；銅綠假單胞菌——溴化十六烷*銨瓊脂培養(yǎng)基；金黃色葡萄球菌——甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基。

三、菌懸液的制備

取上述培養(yǎng)好的菌種斜面移入超凈工作臺或生物安全柜，放置室溫后，用接種環(huán)取菌苔少許接種置營養(yǎng)肉湯中(5mL/支，已滅菌), 將已接種畢的細菌管置35~37℃培養(yǎng)18~24小時，取出備用。一般于冰箱中保存可用7天。

四、對照用菌液制備

取上述培養(yǎng)好的營養(yǎng)肉湯菌懸液（濃菌液1mL，加到9mL，0.9%無菌氯化鈉溶液混勻，為10-1，再取另一只吸管吸取10-1菌液1mL加到9mL，0.9%無菌氯化鈉溶液混勻，為10-2……以此類推，稀釋至含活菌數在50 ~ 100個。用平板計數。此稀釋菌液用于試驗后加陽性對照，可在1天內使用。

五、菌種保管

菌種保管應有專人負責，保存與加鎖的冰箱中或特制的白鐵箱中加鎖置陰暗處，確保菌種安全。因工作變動時，必須做好交接工作。菌種應有詳細登記本，包括名稱、分離日期、鑒定日期、鑒定者、主要鑒定性能，并注意記錄使用、轉移及銷毀情況和原因。各種菌種應按規(guī)定時間定期移種。一般每移種3次后作一次全面鑒定。注意菌種有無污染和變異，如，發(fā)現(xiàn)污染和變異時，應及時更換。購置菌種，應有介紹信。全部保存菌種應具備清單，并定期向部門負責人報告。