以下是影響ELISA檢測(cè)的關(guān)鍵因素，也是實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常出現(xiàn)問(wèn)題及實(shí)用對(duì)策：

1、為什么所有試劑和檢測(cè)樣本要平衡至室溫后再進(jìn)行加樣操作？

 溫度是ELISA結(jié)合反應(yīng)的重要影響因素。為了使所有樣本在一致的溫度下反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)前務(wù)必將所有試劑平衡至室溫，包括檢測(cè)樣本。避免因溫度的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)差異而導(dǎo)致ELISA檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。

2、為什么標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較差？

按照推薦方式保存標(biāo)準(zhǔn)品；溶解標(biāo)準(zhǔn)品之前需短暫離心，*收集粉末；確保標(biāo)準(zhǔn)品*溶解和混勻（大約10min），然后再進(jìn)行后續(xù)的系列稀釋步驟，確保每一步都充分混勻且精確移液；顯色的恰當(dāng)終止；選擇合適的數(shù)學(xué)擬合方程繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3、ELISA實(shí)驗(yàn)為什么必須設(shè)置復(fù)孔？

為獲得更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，強(qiáng)烈建議標(biāo)準(zhǔn)品及樣本進(jìn)行復(fù)孔檢測(cè)。

因?yàn)閺?fù)孔檢測(cè)可以：

★計(jì)算平均值，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確；

★解決實(shí)驗(yàn)中誤操作造成的跳孔現(xiàn)象；

★計(jì)算CV值，對(duì)實(shí)驗(yàn)的操作和試劑盒的精密度進(jìn)行評(píng)估。

4、為什么實(shí)驗(yàn)過(guò)程中孵育、洗滌需要振蕩？如何振蕩？

振蕩孵育使反應(yīng)更充分，振蕩洗滌使背景更干凈。建議使用酶標(biāo)專用96孔微孔板振蕩器。

孵育過(guò)程振蕩，可以加快、加強(qiáng)抗原抗體間的相互碰撞接觸，使得反應(yīng)過(guò)程更加*，OD值通常會(huì)比未振蕩孵育的結(jié)果要高；洗滌過(guò)程振蕩，可以使洗板更干凈，在很大程度上能降低背景值，同時(shí)可以提高試劑盒檢測(cè)的靈敏度。

5、何時(shí)終止ELISA反應(yīng)？

ELISA實(shí)驗(yàn)最終需要酶催化底物顯色反應(yīng)來(lái)完成，在最合適的時(shí)間終止反應(yīng)是ELISA實(shí)驗(yàn)成功的重要因素。在HRP-TMB酶反應(yīng)系統(tǒng)中，當(dāng)最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品顏色不再變深，倒數(shù)2-3個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品顏色開(kāi)始有淺藍(lán)色時(shí)，便需要終止反應(yīng)；或者也可以根據(jù)最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔在620nm的OD值來(lái)決定，OD620=0.9-0.95之間時(shí)即可終止。

6、為什么酶標(biāo)儀讀數(shù)時(shí)必須選用雙波長(zhǎng)？

首先，酶標(biāo)儀使用前務(wù)必預(yù)熱10-15min，使測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。其次，ELISA實(shí)驗(yàn)采用雙波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，可以排除單波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)的測(cè)定干擾（標(biāo)本的濃度，干擾色等）。一般采用最大波長(zhǎng)作為參照波長(zhǎng)，在參照波長(zhǎng)下，檢測(cè)物的吸光值最小，檢測(cè)波長(zhǎng)和參照波長(zhǎng)的吸光值之差可以消除非特異性吸收；因此，雙波長(zhǎng)測(cè)定，可最大限度的消除指紋、雜質(zhì)及不透光的物質(zhì)對(duì)酶標(biāo)儀讀數(shù)帶來(lái)的誤差，以保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。