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PCR產(chǎn)物常用的直接純化技術(shù)方法
閱讀:42 發(fā)布時間:2025-2-14PCR產(chǎn)物一般都含有過量的引物、 Taq DNA酶及dNTP,這些成分的存在將直接影響到后續(xù)的酶切、雙脫氧PCR測序反應(yīng)等過程,因此有必要除去。目前核酸純化的方法有很多,商用化試劑盒的出現(xiàn)使得DNA的純化過程變得更加簡便快捷。PCR擴增完成后需要進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,在條帶單一無其他雜帶的情況下,可以直接對產(chǎn)物進行純化,常見的純化方法有:
一、產(chǎn)物直接純化:
1、硅膠層析柱法
原理:大多數(shù)離心柱中吸附DNA的是一層硅膠膜,實際上就是一層玻璃纖維,其表面有大量修飾的硅羥基(Si-OH),硅羥基在溶液中解離后帶負電,然后與帶正電鹽離子、帶負電DNA形成電橋,從而吸附住DNA,使得DNA雙鏈變單鏈,不會被生物大分子溶劑洗脫,但能經(jīng)水溶性緩沖液水化后,被定量回收,從而實現(xiàn)純化分離。
圖1 硅膠層析原理示意圖
2、磁珠法(abs60151)
原理:磁珠是有磁性的能吸附DNA的物質(zhì),其內(nèi)部核心是鐵離子,在磁場作用下可以吸附在磁體上。在核心外,經(jīng)過羧化,帶有羧基基團,在特定的離子條件下,可以與DNA結(jié)合。結(jié)合后,在外磁場的作用下,磁珠與DNA結(jié)合體移動到磁體周圍,可以很方便去除其他多余的液體,這時,不能與磁珠結(jié)合的所有雜質(zhì)都隨水溶液一并去除。然后,在洗脫條件下,DNA與磁珠分離,溶解在水中,將溶解有DNA的溶液轉(zhuǎn)移,就得到了純化后的DNA樣本。
圖2 磁珠法結(jié)構(gòu)示意圖
3、其他純化方法
①滲透液結(jié)合醇沉純化
原理:利用分子大小不同,小分子的物質(zhì)能夠通過滲透膜溶解到大量的溶液中去,而大分子的物質(zhì)不能通過滲透膜,所以繼續(xù)留存在透析袋中,通過乙醇沉淀最后達到去除小分子物質(zhì),得到純化的有機大分子的效果。
②直接沉淀純化
原理:DNA分子在高鹽離子醇溶液中會被沉淀出來,而其他物質(zhì)繼續(xù)溶液在溶液中,沉淀出來的DNA分子經(jīng)過離心與溶液成分分開,達到純化的目的。
不同純化方法對比:
二、其它,凝膠回收純化:
如電泳檢測結(jié)果存在非特異性條帶,則需要將目的條帶切出來,再用膠回收試劑盒(abs60098)對凝膠進行回收純化,相較于直接純化,只是多了一步溶膠的過程,相應(yīng)的產(chǎn)物純度提高,回收率則下降。
結(jié)語:
在PCR擴增完成后,反應(yīng)體系中除了DNA片段,還存在離子、dNTP、引物及聚合酶等物質(zhì),這些物質(zhì)會影響后續(xù)克隆測序等實驗,因此對其產(chǎn)物進行純化是必要步驟,不同的純化手段各有自己的優(yōu)缺點,可以根據(jù)自己的需求選擇適合自己的方法。