PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應）是一種在體外模擬DNA復制過程的技術(shù)。通過設計特異性引物，PCR可以擴增目標DNA片段，使其在短時間內(nèi)達到可檢測的水平。PCR主要包括三個階段：變性、退火和延伸。熒光定量PCR原理：熒光定量PCR在傳統(tǒng)PCR基礎上，引入了熒光標記技術(shù)。

根據(jù)熒光標記物的不同，熒光定量PCR可分為兩種：染料法和探針法。

（1）染料法

染料法利用一種能與雙鏈DNA特異性結(jié)合的熒光染料，如SYBR Green I。在PCR反應體系中，染料與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光信號增強。隨著PCR反應的進行，擴增產(chǎn)物不斷積累，熒光信號也隨之增強。通過實時監(jiān)測熒光信號的變化，可以計算出目標DNA的初始濃度。

（2）探針法

探針法采用一種特異性熒光標記的探針，如TaqMan探針。探針的5'端標記報告熒光基團，3'端標記淬滅熒光基團。在探針完整時，報告熒光基團的熒光信號被淬滅基團抑制。當PCR反應進行到退火階段，探針與目標DNA特異性結(jié)合，Taq酶的5'→3'外切酶活性將探針切斷，使報告熒光基團與淬滅熒光基團分離，熒光信號得以釋放。通過實時監(jiān)測熒光信號的變化，可以實現(xiàn)對目標DNA的定量。

熒光定量PCR操作技術(shù)：

1. 實驗前準備

（1）試劑與儀器：主要包括熒光定量PCR試劑盒、熒光定量PCR儀、離心機、移液器等。

（2）樣本處理：提取目標DNA或RNA，確保純度和濃度達到實驗要求。

（3）引物和探針設計：根據(jù)目標基因序列，設計特異性引物和探針。

2. 實驗步驟

（1）配制反應體系：根據(jù)試劑盒說明書，將PCR反應所需試劑混合，包括引物、探針、DNA模板、dNTPs、Taq酶等。

（2）PCR擴增：將反應體系放入熒光定量PCR儀，按照以下程序進行擴增：

- 變性：95℃，30秒

- 退火：55-65℃，30秒

- 延伸：72℃，30秒

一般為40個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號。

（3）數(shù)據(jù)分析：根據(jù)熒光信號的變化，繪制擴增曲線和熔解曲線。通過分析擴增曲線，可以得到目標DNA的初始濃度；熔解曲線可以判斷擴增產(chǎn)物是否特異性。

熒光定量PCR應用：

1. 科研領(lǐng)域：熒光定量PCR廣泛應用于基因表達分析、基因突變檢測、微生物檢測等領(lǐng)域。

2. 臨床診斷：熒光定量PCR在病原體檢測、腫瘤基因診斷、遺傳病篩查等方面具有重要應用價值。

3. 食品安全：用于檢測食品中的微生物、轉(zhuǎn)基因成分等。

4. 環(huán)境監(jiān)測：用于檢測環(huán)境樣品中的微生物、病原體等。