ELISA試劑盒在實驗中如何操作說明

的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結(jié)果準確可靠的必要條件。ELISA的操作因固相載體的形成不同而有所差異，國內(nèi)醫(yī)學(xué)檢驗一般均用板式。本文將敘述板式ELISA各個操作步驟的注意要點（珠式、管式及磁性球ELSIA，國外試劑均與特殊儀器配合應(yīng)用，兩者均有詳細的使用說明，須嚴格遵照規(guī)程操作）。

標本的采取和保存

通常我們可用于ELISA檢測的樣本是有多種類型的，如血清、血漿、尿液、細胞培養(yǎng)上清或組織勻漿液等，不同類型的檢測樣本前期的處理方法是不一樣的。正確的處理樣本是保證ELISA檢測的正確性和準確性的步，下面簡單介紹一下不同類型的樣本的處理方法。

血清

血清是常用于ELISA檢測的一類樣本，處理也比較簡單。

用無熱原、無內(nèi)毒素的試管或離心管采集血液標本，將試管或離心管室溫放置2小時或4℃過夜，使血清析出。（將試管或離心管傾斜放置，使液面橫截面增大，能使血清更大程度的析出。）4℃1000×g離心20min，仔細收集上清。建議將血清分裝多份，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

采血過程中應(yīng)避免溶血，因為紅細胞裂解時會釋放具有過氧化酶活性的物質(zhì)，在以HRP為標記的ELISA檢測中會有非特異性的顯色，而導(dǎo)致檢測的不準確性。同時也應(yīng)避免細菌污染，因為菌體內(nèi)可能含有內(nèi)源性的HRP從而導(dǎo)致檢測的假陽性。

血漿

用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液標本，標本采集后30min內(nèi)4℃1000×g離心15min，取上清即血漿。將上清分裝多份，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。避免使用溶血或高血脂的標本。

常用的抗凝劑為EDTA、肝素鈉和枸櫞酸鈉等，檢測時還應(yīng)仔細閱讀試劑盒說明書，檢查試劑盒是否對抗凝劑有特殊要求。

細胞培養(yǎng)上清

取細胞培養(yǎng)上清到離心管，1000×g離心20min，除去細胞碎片及雜質(zhì)，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。 

細胞裂解液

1) 吸去培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)基，用胰酶消化細胞，加適量培養(yǎng)基將細胞從培養(yǎng)板上吹下來。懸浮細胞可省略。

2) 收集細胞懸液，1000×g離心10min，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS潤洗3次。

3) 加入適量的預(yù)冷PBS或細胞裂解液（臨用前加入蛋白酶抑制劑）重懸細胞。通常6孔板一個孔的細胞量需要150~250μL PBS重懸。

4) 將樣品放入-20℃或-80℃，使樣品冷凍，再放室溫解凍樣品，反復(fù)凍融幾次，使細胞充分裂解。也可將樣品進行超聲破碎，以達到裂解的目的。

5) 4℃10000×g 離心10min，除去細胞碎片，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

組織勻漿液

1) 將組織樣本用PBS (0.01M, PH 7.4) 沖洗，洗去組織表面殘留的血液或雜質(zhì)。

2) 將組織塊稱重，記錄后剪碎，碎塊應(yīng)盡量小，便于勻漿得更充分。

3) 將組織按一定的比例加入預(yù)冷的PBS（臨用前加入蛋白酶抑制劑）勻漿，勻漿時置于冰上或冰浴中。（通常按組織重量：PBS體積=1:9的比例勻漿，例如1g的組織樣本對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整，檢測后計算樣品濃度時應(yīng)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)）。

4) 吸取勻漿液到離心管，4℃5000×g 離心5~10min，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

尿液、唾液等其他液體生物樣本

1000×g離心20min，取上清即可檢測。

總的來說，因為ELISA只能檢測可溶性蛋白的含量，所以應(yīng)保證所有樣本均為澄清的液體，沉淀或懸浮物都應(yīng)離心去除。

為了保證檢測的準確性，保存于-20℃或-80℃的樣本在1~6個月內(nèi)檢測；4℃保存的樣本應(yīng)在1周內(nèi)進行檢測。

另外，還應(yīng)保證樣本不含NaN3，因為NaN3會抑制HRP的活性，從而導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。

試劑的準備

按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液、洗滌液應(yīng)用pH計測量。從冰箱中取出的試驗用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用，一般室溫平衡不低于30min。試劑盒中本次試驗不需用的部分應(yīng)及時放回冰箱保存。

加樣

在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。

加標本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣（一般不建議使用）。有些指標檢測（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標本，然后在微型震蕩器上震蕩1min。加酶結(jié)合物工作液和底物工作液時可用多道移液器，使加液過程在短時間內(nèi)完成。