ELISA試劑盒測定中試劑的準備優(yōu)為關鍵

   接下來小編為大家介紹ELISA試劑盒測定中試劑的準備尤為關鍵有那些。在實驗開始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20分鐘以上后，再進行測定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。這樣做的目的，主要是為了在后面的溫育反應步驟中，能使反應微孔內(nèi)的溫度能較快地達到所要求的高度，以滿足測定要求。

以下幾點：

    ①磷酸鈉鹽緩沖液(0.1mol/LpH6.0)：稱Na2HPO4·12H2O2.2g，NaH2PO4·2H2O6.84g，用蒸餾水溶解，定容至500mL。

    ②TMB貯液：稱60mgTMB溶于10mL二甲基亞砜中，4℃避光保存。

    ③底物應用液：現(xiàn)用現(xiàn)配，磷酸鈉緩沖液10mL，TNB貯液10μL。30%H2O215μL，混勻。

    7.終止液：2mol/LH2SO4

操作步驟

    ①抗原包被：兔抗人作為抗原，用包被液l：8000稀釋，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應板中。4℃放置第二天。

    ②洗滌：次日傾去凹孔內(nèi)的液體，洗滌液洗3次。

    ③封閉：加l00μL/孔封閉液，室溫放置0.5h。

    ④洗滌：用洗滌液洗3次。

    ⑤加待測樣品(一抗)：將含單克降抗體的細胞培養(yǎng)上清在另—塊板上用PBS連續(xù)稀釋(按照1：2或1：10)，100μL/孔加到已包被的板上，每個樣品平行做兩份，PBS或空白培養(yǎng)基作為陰性對照，已知樣品作為陽性對照。加蓋37℃恒溫箱溫育1~2h。

    ⑥洗滌：用洗滌液洗3次。

    ⑦加酶標抗抗體：兔抗鼠，用封閉液l：8000稀釋，100μL/孔，加蓋37℃恒溫箱溫育1h。

    ⑧洗滌：用洗滌液洗5次，蒸餾水洗2次。

    ⑨顯色：加新鮮配制的底物溶液100μL/孔，室溫暗處放置5～30min，顯示藍色。

    ⑩終止反應、比色：加50μL/孔終止液.顏色變黃;用酶標儀測定450nm處各孔的吸光值，陽性反應的大稀釋度為待測樣品的效價。

    目前的商品ELISA試劑盒中的洗板液均需在實驗室使用時對所提供的濃縮液稀釋配制，因此稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應保證質(zhì)量。此外，當試劑盒以OPD為底物時，則底物溶液應在反應顯色前臨時配制。