轉(zhuǎn)基因品系油菜25-18-17探針法qPCR試劑盒

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服務(wù)流程：
接受訂單及樣品——RNA提取——RNA質(zhì)量檢測(cè)——樣品cDNA合成——定量試驗(yàn)——數(shù)據(jù)分析——結(jié)果交付——售后服務(wù)。

實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：
1）RT-PCR可以檢測(cè)組織、細(xì)胞、血液、細(xì)菌等很多材料，不同的樣本有不同要求，實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)充分溝通確認(rèn)實(shí)驗(yàn)方案和樣本情況；
2）客戶盡可能提供實(shí)驗(yàn)的背景信息、物種、基因準(zhǔn)確的名稱和ID號(hào)；
3）客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品。
4）樣本保存于液氮或干冰，也可以保存于Trizol液中。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩類，探針類是利用與靶細(xì)胞序列特異性雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，非探針類是利用熒光染料或者特異性設(shè)計(jì)的引物來指示擴(kuò)增的增加。運(yùn)用該技術(shù)可以對(duì)DNA、RNA樣品進(jìn)行定量（包括定量和相對(duì)定量）和定性分析。主要服務(wù)：DNA或RNA的定量分析、基因表達(dá)差異分析、基因分型。
實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
      10×PCR buffer             5μl
      dNTP mixl                 4μl
      引物1（10pM）               2μl
      引物2（10PM）              2μl
     Taq酶（2U/μl）            1μl
     DNA模板（50ng-1μg/μl）    1 μl
      加ddH2O至               50 μl
    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
檢測(cè)方法包括以下步驟：
(1)將參照基因與待測(cè)目的基因片段等比例連接，克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上，構(gòu)建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測(cè)目的基因擴(kuò)增檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品，并將所得標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測(cè)目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(2)待測(cè)樣本與步驟(1)所述標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增后，目的基因與參照基因按照各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自的拷貝數(shù)，計(jì)算待測(cè)樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值，即得目的基因的拷貝數(shù)相對(duì)定量檢測(cè)結(jié)果。
其中步驟(1)為：將參照基因與待測(cè)目的基因片段等比例連接，克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上，構(gòu)建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測(cè)目的基因擴(kuò)增檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品，并將所得標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測(cè)目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
其中所述參照基因?yàn)楸绢I(lǐng)域常規(guī)參照基因，較佳地管家基因，優(yōu)選地為RPPH1的擴(kuò)增區(qū)域，其中所述質(zhì)粒載體為本領(lǐng)域常規(guī)質(zhì)粒載體，較佳地為PCR克隆載體，優(yōu)選地為TA cloning載體，所述TA cloning載體較佳地為pMD18-T載體。其中所述標(biāo)準(zhǔn)品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。所述的等比例較佳地為1：1。由于標(biāo)準(zhǔn)品中待測(cè)目的基因與參照基因的比例為1:1，解決了目前相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法應(yīng)用中目的基因與參照基因的濃度比例關(guān)系難以控制的問題，提高HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)的可靠性。
步驟(2)為：待測(cè)樣本與步驟(1)所述標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增后，目的基因與參照基因按照各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自的拷貝數(shù)，計(jì)算待測(cè)樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值，即得目的基因的拷貝數(shù)相對(duì)定量檢測(cè)結(jié)果。
其中所述待測(cè)目的基因?yàn)楸绢I(lǐng)域常規(guī)待測(cè)目的基因，較佳地為腫瘤或者疾病的特異性基因，更佳地為HER2基因的擴(kuò)增區(qū)域，所述熒光定量PCR擴(kuò)增為本領(lǐng)域常規(guī)熒光定量PCR擴(kuò)增方法，所述熒光定量PCR擴(kuò)增方法較佳地為多通道熒光定量PCR擴(kuò)增，更佳地為雙通道熒光定量PCR擴(kuò)增。
儲(chǔ)存條件：
14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
甘氨鵝脫氧膽酸Dynamin-I (3G4B6) Mouse mAb二基二甲基化銨

?；秦i去氧膽酸鈉TBR1 (D6C6X) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjuga)二月桂酸二丁基錫

磺丁基-β-環(huán)糊精;磺丁基倍他環(huán)糊精鈉Axl (C44G1) Rabbit mAb谷胱甘肽

纈氨霉素Fumarase (D9C5) Rabbit mAb光穩(wěn)定劑 TH-944

5--1，二甲基吡唑 Phospho-IGF-I Receptor β (Tyr980) (C14A11) Rabbit mAb受阻光穩(wěn)定劑 HS-944

甘氨脫氧膽酸鈉(進(jìn)分)Phospho-Cortactin (Tyr421) Antibody過硫酸

?；蛆Z去氧膽酸鈉TNK1 (C44F9) Rabbit mAb甲基二硅烷

甘氨脫氧膽酸(GDCA)Mcl-1 Antibody甲基膦酸二甲酯

衣霉素 Phospho-PSD95 (Ser295) (A8F8Z) Rabbit mAb甲基溴化鎂

吲哚-甲酸甲酯 Cool2/αPix (C23D2) Rabbit mAb甲氧芐啶

甲溴東莨菪(標(biāo)準(zhǔn)品)FGF Receptor 3 (C51F2) Rabbit mAb氟基酸

脫氧膽酸鈉；去氧膽酸鈉Lyn (5G2) Mouse mAb十水合硫酸鈉

?；切苋パ跄懰?/font>Phospho-FLT3 (Tyr842) (10A8) Rabbit mAb2-甲

?；切苋パ跄懰徕cBACH1/BRIP1 Antibody化鈷

7-基氨酰基庚酸Phospho-Mcl-1 (Ser159/Thr163) Antibody

新生霉素鈉鹽Phospho-Bim (Ser69) Antibody無水化銅

磺甲基嘧啶(標(biāo)準(zhǔn)品)CRYAB (D6S9E) Rabbit mAb咪唑并[1,2-b]噠

井岡霉素SDH5 (D1S8D) Rabbit mAb頻哪酮
轉(zhuǎn)基因品系油菜25-18-17探針法qPCR試劑盒動(dòng)物組織活性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離　MBD2 　100 ul

動(dòng)物細(xì)胞高純內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離　LCMT1(Leucine carboxyl methyltransferase 1) 　5 mg

動(dòng)物組織高純內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離　DNASE2(Deoxyribonuclease-2-alpha) 　100 ug

通用型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)染色　Anti-LAMP2(Anti-lysosomal Associated Membrane Protein 2 Antibody) 　100 ul

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)高質(zhì)染色　anti-2019-nCoV(N) IgG  　100 ul

動(dòng)物組織肌質(zhì)網(wǎng)粗提分離　anti-2019-nCoV(N) IgM  　100 ul

動(dòng)物組織活性肌質(zhì)網(wǎng)分離　FOLR3(Folate receptor gamma) 　300 ul

動(dòng)物組織高質(zhì)純化肌質(zhì)網(wǎng)分離　CTHRC1(Collagen triple helix repeat-containing protein 1) 　100 ul

動(dòng)物組織肌質(zhì)網(wǎng)橫小管（T Tube）分離　CH25H(Cholesterol 25-hydroxylase) 　1 vial

動(dòng)物組織肌質(zhì)網(wǎng)三聯(lián)體（TRIAD）分離　CAMK2B(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type II subunit beta) 　100 ug

動(dòng)物細(xì)胞核分離　CDCA8(Cell division cycle-associated protein 8) 　100 ul

細(xì)胞微管分離　MAP4K4 　100 ug

細(xì)胞/組織溶酶體粗提分離　MAP4K5 　100 ul

細(xì)胞/組織活性溶酶體分離　Matrilin 2 　100 ul

細(xì)胞/組織高質(zhì)純化溶酶體分離　MAPK11(Mitogen-activated protein kinase 11) 　100 ul

細(xì)胞過氧化酶體分離　MAP7 　20 ul