轉(zhuǎn)基因品系甜菜H7-1 染料法qPCR試劑盒

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服務(wù)流程：
接受訂單及樣品——RNA提取——RNA質(zhì)量檢測——樣品cDNA合成——定量試驗——數(shù)據(jù)分析——結(jié)果交付——售后服務(wù)。

實驗注意事項：
1）RT-PCR可以檢測組織、細(xì)胞、血液、細(xì)菌等很多材料，不同的樣本有不同要求，實驗前請充分溝通確認(rèn)實驗方案和樣本情況；
2）客戶盡可能提供實驗的背景信息、物種、基因準(zhǔn)確的名稱和ID號；
3）客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品。
4）樣本保存于液氮或干冰，也可以保存于Trizol液中。
實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實時熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩類，探針類是利用與靶細(xì)胞序列特異性雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加，非探針類是利用熒光染料或者特異性設(shè)計的引物來指示擴增的增加。運用該技術(shù)可以對DNA、RNA樣品進(jìn)行定量（包括定量和相對定量）和定性分析。主要服務(wù)：DNA或RNA的定量分析、基因表達(dá)差異分析、基因分型。
實驗過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
      10×PCR buffer             5μl
      dNTP mixl                 4μl
      引物1（10pM）               2μl
      引物2（10PM）              2μl
     Taq酶（2U/μl）            1μl
     DNA模板（50ng-1μg/μl）    1 μl
      加ddH2O至               50 μl
    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
檢測方法包括以下步驟：
(1)將參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個質(zhì)粒載體上，構(gòu)建一種可同時用于參照基因以及待測目的基因擴增檢測的標(biāo)準(zhǔn)品，并將所得標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度稀釋后同時用于繪制參照基因以及待測目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(2)待測樣本與步驟(1)所述標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)同步進(jìn)行實時熒光定量PCR擴增后，目的基因與參照基因按照各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各自的拷貝數(shù)，計算待測樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值，即得目的基因的拷貝數(shù)相對定量檢測結(jié)果。
其中步驟(1)為：將參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個質(zhì)粒載體上，構(gòu)建一種可同時用于參照基因以及待測目的基因擴增檢測的標(biāo)準(zhǔn)品，并將所得標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度稀釋后同時用于繪制參照基因以及待測目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
其中所述參照基因為本領(lǐng)域常規(guī)參照基因，較佳地管家基因，優(yōu)選地為RPPH1的擴增區(qū)域，其中所述質(zhì)粒載體為本領(lǐng)域常規(guī)質(zhì)粒載體，較佳地為PCR克隆載體，優(yōu)選地為TA cloning載體，所述TA cloning載體較佳地為pMD18-T載體。其中所述標(biāo)準(zhǔn)品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。所述的等比例較佳地為1：1。由于標(biāo)準(zhǔn)品中待測目的基因與參照基因的比例為1:1，解決了目前相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法應(yīng)用中目的基因與參照基因的濃度比例關(guān)系難以控制的問題，提高HER2基因擴增檢測的可靠性。
步驟(2)為：待測樣本與步驟(1)所述標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)同步進(jìn)行實時熒光定量PCR擴增后，目的基因與參照基因按照各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各自的拷貝數(shù)，計算待測樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值，即得目的基因的拷貝數(shù)相對定量檢測結(jié)果。
其中所述待測目的基因為本領(lǐng)域常規(guī)待測目的基因，較佳地為腫瘤或者疾病的特異性基因，更佳地為HER2基因的擴增區(qū)域，所述熒光定量PCR擴增為本領(lǐng)域常規(guī)熒光定量PCR擴增方法，所述熒光定量PCR擴增方法較佳地為多通道熒光定量PCR擴增，更佳地為雙通道熒光定量PCR擴增。
儲存條件：
14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
Fmoc-L-纈氨酸MAVS Antibody2-甲基-硝基吡啶-N-氧化物

Fmoc-N-*基-L-天冬酰MSH6 (P150) Antibody5-甲基-3(2H)-噠酮

N'-芴甲氧羰基-N-芐氧羰基-L-賴氨酸MSH6 (P150) Antibody8-氧-氮雜二環(huán)[3.2.1]辛烷

Fmoc-L-賴氨酸鹽酸鹽IDH1 Antibody三氟磺酸鐿水合物

N-芴甲氧羰基-L-氨酸五氟酯FTH1 Antibody2-甲氧基溴芐,95%

N-α-Fmoc-N-γ-*游基-L-谷氨酸五氟酯Streptavidin-HRP酸三異酯

氧化白藜蘆(標(biāo)準(zhǔn)品)Troponin I Antibody2,6-二甲氧基萘

氧化白藜蘆MCM3 (D47B6) Rabbit mAb1-芐基-羥基氮雜環(huán)丁烷

?；邹继J(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-Troponin I (Cardiac) (Ser23/24) Antibody4,5,6,7-四氫噻吩并[3.2-c]吡啶

酰化白藜蘆PN (D4.3) XP® Rabbit mAb (Biotinylad)-7-氮雜吲哚

N,N'-雙(芴甲氧羰基)-L-賴氨酸五氟基酯Androgen Receptor (D6F11) XP® Rabbit mAb (Biotinylad)穿心蓮內(nèi)酯

Fmoc-N'-甲基*基-L-賴氨酸Phospho-Na6-氨基青霉烷酸

芴甲氧羰基-O-芐基-L-蘇氨酸MCM2 Antibody三(2-呋喃)化氫

N'-Fmoc-L-賴氨酸Calnexin (C5C9) Rabbit mAb (HRP Conjuga)2-氨基-5-甲基吡

Fmoc-天門冬氨酸-β-芐酯Galectin-1/LGALS1 (8A12) Mouse mAb鄰甲基

Fmoc-(吡啶基)-L-氨酸Phospho-p130 Cas (Tyr410) Antibody-氟甲

芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-1-叔丁酯MCM3 Antibody1-Boc-吡唑-酸頻哪酯

N-[(9H-芴-9-甲氧基)羰基]-N'-[(2-氧基)羰基]-L-賴氨酸DPP4/CD26 (D6D8K) Rabbit mAb (IHC Formulad)溴-2-
轉(zhuǎn)基因品系甜菜H7-1 染料法qPCR試劑盒人凝血因子ⅩⅢ(FⅩⅢ)免疫試劑盒脊髓灰質(zhì)炎受體相關(guān)蛋白1MAPK蛋白表達(dá)ELISA定量檢測試劑盒D-纈氨 98%小鼠補體蛋白4（C4）ELISA試劑盒,人凝血因子Ⅷ相關(guān)抗原(Ⅷ-Ag)免疫試劑盒19號染色體開放閱讀框73MAPK蛋白免疫共沉淀分析試劑盒鄰甲 97%大鼠乙醇脫氫酶（ADH）ELISA試劑盒,人凝血因子Ⅶ(FⅦ)免疫試劑盒整合素αMIntegrin αMMAYER蘇木素復(fù)染試劑盒3,4-二甲 99%大鼠血小板膜糖蛋白ⅡbⅢa（GP-ⅡbⅢa/CD41+CD61）ELISA試劑盒,人凝血因子Ⅴ(FⅤ)免疫試劑盒軸突蛋白4/少突膠質(zhì)細(xì)胞McCOY’S 5A培養(yǎng)基3,4-二甲 分析標(biāo)準(zhǔn)品，用于環(huán)境分析大鼠熱休克蛋白60（Hsp-60）ELISA試劑盒,人凝血因子Ⅱ(FⅡ)免疫試劑盒軸突相關(guān)CNTP2蛋白（少突膠質(zhì)細(xì)胞）MEM培養(yǎng)基間二芐 97%大鼠心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cTn-Ⅰ）ELISA試劑盒,人凝血酶原前體蛋白(PIVKA-II)免疫試劑盒酪蛋白激酶δ1MGMT基因甲基化程度定量分析試劑盒2,4-二 98%大鼠抑制素A（INH-A）ELISA試劑盒,人凝血酶原片段F1+2(F1+2)免疫試劑盒活化白細(xì)胞粘附分子MHPG高效液相色譜電化學(xué)定量檢測試劑盒對甲 97%大鼠胃動素（MTL）ELISA試劑盒,人凝血酶血栓調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物(T-TM)免疫試劑盒1號染色體開放閱讀框191Michel固著液對甲 ≥97%,Kosher大鼠生長抑素（SS）ELISA試劑盒,