轉(zhuǎn)基因品系玉米678 PCR試劑盒

服務(wù)流程：
接受訂單及樣品——RNA提取——RNA質(zhì)量檢測——樣品cDNA合成——定量試驗(yàn)——數(shù)據(jù)分析——結(jié)果交付——售后服務(wù)。

儲(chǔ)存條件：
14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
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實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：
1）RT-PCR可以檢測組織、細(xì)胞、血液、細(xì)菌等很多材料，不同的樣本有不同要求，實(shí)驗(yàn)前請充分溝通確認(rèn)實(shí)驗(yàn)方案和樣本情況；
2）客戶盡可能提供實(shí)驗(yàn)的背景信息、物種、基因準(zhǔn)確的名稱和ID號(hào)；
3）客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品。
4）樣本保存于液氮或干冰，也可以保存于Trizol液中。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩類，探針類是利用與靶細(xì)胞序列特異性雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，非探針類是利用熒光染料或者特異性設(shè)計(jì)的引物來指示擴(kuò)增的增加。運(yùn)用該技術(shù)可以對DNA、RNA樣品進(jìn)行定量（包括定量和相對定量）和定性分析。主要服務(wù)：DNA或RNA的定量分析、基因表達(dá)差異分析、基因分型。
寡核苷酸探針非同位素辛化學(xué)發(fā)光法RNA　HAV-IgM(hepatitis A virus-Immunoglobulin M) 　20 ul

北方雜交*　Cytochrome b-245 Beta Polypeptide 　100 ul

寡核苷酸探針非同位素HRP－DAB顯色法RNA　NADPH oxidase 5 　20 ul

寡核苷酸探針非同位素AP－BCIP/NBT法RNA　TRXR3(Thioredoxin reductase 3) 　300 ul

寡核苷酸探針非同位素辛AP－BCIP/NBT法RNA北方雜交*　PARK2(E3 ubiquitin-protein ligase parkin) 　100 ul

差異相減雜交　MFN2(Mitofusin-2) 　100 ul

BLOTTO 10核酸雜交封閉溶液　NT-proCNP(N-Terminal Pro-C-Type Natriuretic Peptide) 　100 ul

超聲化鮭魚精單鏈DNA　VDAC1(Voltage-dependent anion-selective channel protein 1) 　100 ul

雜交清洗液　ASMA(Anti Smooth Muscle Antibody) 　300 ul

甲醛RNA電泳上樣緩沖液（RNA酶保護(hù)）　ILDR2(Immunoglobulin-like domain-containing receptor 2) 　100 ul

RNA酶溶液（RNA酶保護(hù)分析）　NPY(Neuropeptide Y) 　100 ul

50倍Dendhart核酸雜交封閉溶液　HAS3(Hyaluronan Synthase 3) 　10 mg

總微型RNA（miRNA）電泳法分離　PRODH(Proline dehydrogenase 1, mitochondrial) 　100 ul

總微型RNA（miRNA）超濾法分離　DJ-1/PARK 7 　20 ul

胞漿微型RNA（miRNA）電泳法分離　NAC-alpha(Nascent polypeptide-associated complex subunit alpha) 　100 ul

胞漿微型RNA（miRNA）超濾法分離　GRIA1(Glutamate receptor 1) 　20 ul
轉(zhuǎn)基因品系玉米678 PCR試劑盒Escherichia│coli提供形式: 凍干物安全等級: 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基: 33生長條件: 37℃存儲(chǔ)條件: 真空冷凍干燥法

杰丁漢遜酵母種屬: Hansenula│jadinii提供形式: 凍干物安全等級: 1模式菌株: yes培養(yǎng)基: 0013或0072生長條件: 25-28℃存儲(chǔ)條件: 真空冷凍干燥法；礦物油法

Kuehneromyces│mutabilis (Schaeff.) Singer & A.H. Sm.分離基物: 菌蓋或菌柄提供形式: 斜面培養(yǎng)物安全等級: 1模式菌株: no培養(yǎng)基: 14生長條件: 26存儲(chǔ)條件: 定期移植法

Glomerla│cingulata提供形式: 凍干物安全等級: 1模式菌株: no培養(yǎng)基: 0015生長條件: 25-28℃存儲(chǔ)條件: 真空冷凍干燥法；礦物油法；定期移植法

Staphylococcus│xylosus分離基物: 土壤提供形式: 斜面培養(yǎng)物安全等級: 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 耐受10%的NaCl培養(yǎng)基: 0002生長條件: 30℃存儲(chǔ)條件: -80℃冰箱凍結(jié)法；定期移植法

Strepococcus│agalactiae提供形式: 凍干物安全等級: 2模式菌株: no培養(yǎng)基: CM0051生長條件: 37℃存儲(chǔ)條件: 真空冷凍干燥法

Microbacterium│ginsengisoli分離基物: 沉積物/箱式沉積物提供形式: 凍干物安全等級: 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 產(chǎn)酶微生物/產(chǎn)淀粉酶、過氧化氫酶；未檢測到果膠酶、酪蛋白酶、纖維素酶、瓊脂酶培養(yǎng)基: 471生長條件: 30℃存儲(chǔ)條件: 液氮超低溫凍結(jié)法；-80℃冰箱凍結(jié)法；真空冷凍干燥法

Deinococcus│deserti分離基物: 土壤提供形式: 凍干物安全等級: 1模式菌株: no培養(yǎng)基: 832生長條件: 30℃存儲(chǔ)條件: 真空冷凍干燥法

Bacillus│licheniformis提供形式: 凍干物安全等級: 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 纖維素降解菌培養(yǎng)基: 0033生長條件: 30℃存儲(chǔ)條件: 液氮超低溫凍結(jié)法;真空冷凍干燥法
實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
      10×PCR buffer             5μl
      dNTP mixl                 4μl
      引物1（10pM）               2μl
      引物2（10PM）              2μl
     Taq酶（2U/μl）            1μl
     DNA模板（50ng-1μg/μl）    1 μl
      加ddH2O至               50 μl
    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
檢測方法包括以下步驟：
(1)將參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上，構(gòu)建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測目的基因擴(kuò)增檢測的標(biāo)準(zhǔn)品，并將所得標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(2)待測樣本與步驟(1)所述標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增后，目的基因與參照基因按照各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自的拷貝數(shù)，計(jì)算待測樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值，即得目的基因的拷貝數(shù)相對定量檢測結(jié)果。
其中步驟(1)為：將參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上，構(gòu)建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測目的基因擴(kuò)增檢測的標(biāo)準(zhǔn)品，并將所得標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
其中所述參照基因?yàn)楸绢I(lǐng)域常規(guī)參照基因，較佳地管家基因，優(yōu)選地為RPPH1的擴(kuò)增區(qū)域，其中所述質(zhì)粒載體為本領(lǐng)域常規(guī)質(zhì)粒載體，較佳地為PCR克隆載體，優(yōu)選地為TA cloning載體，所述TA cloning載體較佳地為pMD18-T載體。其中所述標(biāo)準(zhǔn)品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。所述的等比例較佳地為1：1。由于標(biāo)準(zhǔn)品中待測目的基因與參照基因的比例為1:1，解決了目前相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法應(yīng)用中目的基因與參照基因的濃度比例關(guān)系難以控制的問題，提高HER2基因擴(kuò)增檢測的可靠性。
步驟(2)為：待測樣本與步驟(1)所述標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增后，目的基因與參照基因按照各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自的拷貝數(shù)，計(jì)算待測樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值，即得目的基因的拷貝數(shù)相對定量檢測結(jié)果。
其中所述待測目的基因?yàn)楸绢I(lǐng)域常規(guī)待測目的基因，較佳地為腫瘤或者疾病的特異性基因，更佳地為HER2基因的擴(kuò)增區(qū)域，所述熒光定量PCR擴(kuò)增為本領(lǐng)域常規(guī)熒光定量PCR擴(kuò)增方法，所述熒光定量PCR擴(kuò)增方法較佳地為多通道熒光定量PCR擴(kuò)增，更佳地為雙通道熒光定量PCR擴(kuò)增。