轉(zhuǎn)基因品系油菜46A40染料法qPCR試劑盒

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服務(wù)流程：
接受訂單及樣品——RNA提取——RNA質(zhì)量檢測——樣品cDNA合成——定量試驗(yàn)——數(shù)據(jù)分析——結(jié)果交付——售后服務(wù)。

實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：
1）RT-PCR可以檢測組織、細(xì)胞、血液、細(xì)菌等很多材料，不同的樣本有不同要求，實(shí)驗(yàn)前請充分溝通確認(rèn)實(shí)驗(yàn)方案和樣本情況；
2）客戶盡可能提供實(shí)驗(yàn)的背景信息、物種、基因準(zhǔn)確的名稱和ID號(hào)；
3）客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品。
4）樣本保存于液氮或干冰，也可以保存于Trizol液中。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩類，探針類是利用與靶細(xì)胞序列特異性雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，非探針類是利用熒光染料或者特異性設(shè)計(jì)的引物來指示擴(kuò)增的增加。運(yùn)用該技術(shù)可以對DNA、RNA樣品進(jìn)行定量（包括定量和相對定量）和定性分析。主要服務(wù)：DNA或RNA的定量分析、基因表達(dá)差異分析、基因分型。
實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
      10×PCR buffer             5μl
      dNTP mixl                 4μl
      引物1（10pM）               2μl
      引物2（10PM）              2μl
     Taq酶（2U/μl）            1μl
     DNA模板（50ng-1μg/μl）    1 μl
      加ddH2O至               50 μl
    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
檢測方法包括以下步驟：
(1)將參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上，構(gòu)建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測目的基因擴(kuò)增檢測的標(biāo)準(zhǔn)品，并將所得標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(2)待測樣本與步驟(1)所述標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增后，目的基因與參照基因按照各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自的拷貝數(shù)，計(jì)算待測樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值，即得目的基因的拷貝數(shù)相對定量檢測結(jié)果。
其中步驟(1)為：將參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上，構(gòu)建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測目的基因擴(kuò)增檢測的標(biāo)準(zhǔn)品，并將所得標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
其中所述參照基因?yàn)楸绢I(lǐng)域常規(guī)參照基因，較佳地管家基因，優(yōu)選地為RPPH1的擴(kuò)增區(qū)域，其中所述質(zhì)粒載體為本領(lǐng)域常規(guī)質(zhì)粒載體，較佳地為PCR克隆載體，優(yōu)選地為TA cloning載體，所述TA cloning載體較佳地為pMD18-T載體。其中所述標(biāo)準(zhǔn)品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。所述的等比例較佳地為1：1。由于標(biāo)準(zhǔn)品中待測目的基因與參照基因的比例為1:1，解決了目前相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法應(yīng)用中目的基因與參照基因的濃度比例關(guān)系難以控制的問題，提高HER2基因擴(kuò)增檢測的可靠性。
步驟(2)為：待測樣本與步驟(1)所述標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增后，目的基因與參照基因按照各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自的拷貝數(shù)，計(jì)算待測樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值，即得目的基因的拷貝數(shù)相對定量檢測結(jié)果。
其中所述待測目的基因?yàn)楸绢I(lǐng)域常規(guī)待測目的基因，較佳地為腫瘤或者疾病的特異性基因，更佳地為HER2基因的擴(kuò)增區(qū)域，所述熒光定量PCR擴(kuò)增為本領(lǐng)域常規(guī)熒光定量PCR擴(kuò)增方法，所述熒光定量PCR擴(kuò)增方法較佳地為多通道熒光定量PCR擴(kuò)增，更佳地為雙通道熒光定量PCR擴(kuò)增。
儲(chǔ)存條件：
14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）　KIFC1( Kinesin family member C1) 　1 Kit

羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH-）　KLF6 　100 ul

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）　KIFC3 　100 ul

過氧化基（peroxyl radical；ROO-）　KLF7 　100 ul

氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）　KIN 　100 ul

氮氧基（nitric Oxide；NO-）　KLF15 　20 ul

次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）　Kindlin 2 　100 ul

過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）　KLF4 　20 ul

烷氧自由基（alcoxyl radical）　KIF19 　100 ul

Alkylperoxyl Radical: ROO.　KLF17 　100 ul

脂質(zhì)氧化　KIF1C 　100 ul

β氧化　KIF22 　100 ul

核酸氧化　KIF20A 　100 ul

蛋白氧化　KIF1B 　20 ul

細(xì)菌氧化應(yīng)激活性氧（ROS）比色法定量（羥自由基）　KIF26B 　100 ul

超氧化物歧化酶（SOD）活性　KIF2A 　1 Kit
轉(zhuǎn)基因品系油菜46A40染料法qPCR試劑盒Streptomyces│sp.分離基物: 沉積物/表層沉積物提供形式: 凍干物安全等級(jí): 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 生物活性微生物：抗菌活性譜:金黃色葡萄球菌 18 枯草芽孢桿菌 20 大腸埃希氏菌 -- 熒光假單胞菌 -- 白假絲酵母 -- 宛氏擬青霉 28培養(yǎng)基: 1002生長條件: 28℃存儲(chǔ)條件: 液氮超低溫凍結(jié)法；-80℃冰箱凍結(jié)法；真空冷凍干燥法

堪薩斯分枝桿菌種屬: Mycobacterium│Mycobacterium kansasii提供形式: 凍干物安全等級(jí): 3模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 研究生長條件: 37存儲(chǔ)條件: 真空冷凍干燥法

Escherichia│coli提供形式: 凍結(jié)物安全等級(jí): 2模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 作為原核表達(dá)系統(tǒng)研究基因表達(dá)的對照菌株。培養(yǎng)基: 33生長條件: 37℃存儲(chǔ)條件: 液氮超低溫凍結(jié)法；-80℃冰箱凍結(jié)法；定期移植法

Corynebacterium│glutamicum提供形式: 凍干物安全等級(jí): 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 產(chǎn)谷氨酸。培養(yǎng)基: CM0108生長條件: 30℃存儲(chǔ)條件: 真空冷凍干燥法

Agrobacterium│tumefaciens提供形式: 凍干物安全等級(jí): 1模式菌株: no培養(yǎng)基: 0032生長條件: 28-30℃存儲(chǔ)條件: 真空冷凍干燥法；礦物油法；定期移植法

Citricoccus│alkalitolerans分離基物: 鹽堿土提供形式: 凍干物安全等級(jí): 1模式菌株: yes應(yīng)用領(lǐng)域: 模式菌株培養(yǎng)基: CM0027+5%NaCl生長條件: 28C存儲(chǔ)條件: 真空冷凍干燥

Sphingobacterium│sp.分離基物: 原料乳提供形式: 凍干物安全等級(jí): 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 可導(dǎo)致乳品蛋白變性培養(yǎng)基: CM0827生長條件: 30℃存儲(chǔ)條件: 真空冷凍干燥法

Saccharothrix│sp.分離基物: 蘭李莖提供形式: 凍干物安全等級(jí): 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 雙功能酶抑制劑培養(yǎng)基: CM0027生長條件: 28C存儲(chǔ)條件: 真空冷凍干燥

Candida│tropicalis分離基物: 生物樣/尖葉鹵蕨根提供形式: 斜面培養(yǎng)物安全等級(jí): 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 近海酵母培養(yǎng)基: 513生長條件: 28℃存儲(chǔ)條件: 液氮超低溫凍結(jié)法；-80℃冰箱凍結(jié)法