人腎足細(xì)胞

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人腎足細(xì)胞

培養(yǎng)基：原代上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系

傳代特性：細(xì)胞特性確定傳代

消化液：0.25%胰dan白酶

培養(yǎng)條件：氣相：  空氣，95%；CO2 ，5%

細(xì)胞簡(jiǎn)介：腎小球?yàn)檫^(guò)濾器，腎小球毛細(xì)血管壁構(gòu)成過(guò)濾膜。腎小球過(guò)濾膜從內(nèi)到外有 三層結(jié)構(gòu)：  內(nèi)層為內(nèi)皮、中層為腎小球基膜、外層為上皮細(xì)胞層，  上皮細(xì)胞又稱 足細(xì)胞，其不規(guī)則突起稱足突，  其間有許多狹小間隙，血液經(jīng)濾膜過(guò)濾后，  濾液 入腎小球囊。在正常情況下，血液中絕大部分蛋白質(zhì)不能濾過(guò)而保留于血液中， 僅小分子物質(zhì)如尿素、葡萄糖、電解質(zhì)及某些小分子蛋白能濾過(guò)。  腎足細(xì)胞即腎 小球上皮細(xì)胞，  它附著于腎小球基底膜的外側(cè)，連同腎小球基底膜和腎小球基膜 一起構(gòu)成了腎小球血液濾過(guò)屏障。又由于正常成年機(jī)體的腎臟足細(xì)胞是一種終末 分化細(xì)胞，  體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞不能增殖。足細(xì)胞呈星型多突狀，  胞體較大，由 胞體伸出許多突起，  呈指狀交叉覆蓋于腎小球基底膜外表面，  并通過(guò)黏附分子和 蛋白多糖分子與腎小球基底膜相連。足細(xì)胞在正常情況下可以分泌腎小球基底膜 的主要組成成分IV型膠原和纖維連接蛋白,在促腎纖維化引資等刺激下還能分泌具 有降解腎小球基底膜作用的基質(zhì)金屬蛋白酶和組織蛋白酶，從而在腎小球基底膜 的代謝平衡中發(fā)揮重要作用。
一、細(xì)胞基本屬性

原代細(xì)胞分離培養(yǎng)的思路：

取材--分離--培養(yǎng)--鑒定

首先將組織從機(jī)體中取出，經(jīng)胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細(xì)胞，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞繁殖到一定系數(shù)后進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

實(shí)驗(yàn)步驟：

一、取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二、在超凈工作臺(tái)中，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開(kāi)顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動(dòng)以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中。

四、用細(xì)解剖鑷去除大腦白質(zhì)、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質(zhì)。

五、大腦皮質(zhì)放于DMEM中，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。

六、室溫1 000×g離心8min，去上清液。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g，20min，4℃離心，去上清。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min，去上清液。

九、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃離心10min。

十、靠近底部的紅細(xì)胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm，6min，室溫)，去上清液。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS，4ug/ml素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過(guò)夜所制備的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含素的混合培養(yǎng)基，隨后隔天換液。

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注意事項(xiàng)：

1. 培養(yǎng)基于4℃條件下可保存3-6個(gè)月。

2. 在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，請(qǐng)注意保持無(wú)菌操作。

3. 傳代培養(yǎng)過(guò)程中，yi酶消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)影響細(xì)胞貼壁及其生長(zhǎng)狀態(tài)。

4. 建議客戶收到細(xì)胞后前3天每個(gè)倍數(shù)各拍幾張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于和技術(shù)部溝通；由于運(yùn)輸?shù)脑?，個(gè)別敏感細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系，詳盡告知細(xì)胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤、回訪直至問(wèn)題得到解決。