人肝動脈內(nèi)皮細胞

人肝動脈內(nèi)皮細胞

一、細胞基本屬性

培養(yǎng)基：含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

包被條件：PLL(0.1mg/ml)，明膠(0.1%)

傳代特性：可傳2-3代

消化液：0.25%胰dan白酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

傳代比例：1:2

細胞簡介：人肝動脈內(nèi)皮細胞分離自肝動脈組織；在胚胎期，肝臟有3條動脈供血，分別來源于胃左 動脈、腹腔動脈和腸系膜上動脈，這3條動脈分別肝臟的不同部位。出生后，一般保 留一條動脈，大部分為起源于腹腔動脈的動脈，由其分出左、右肝動脈供應(yīng)左、右半肝。 偶爾也可見起源于胃左動脈的動脈或起源于腸系膜上動脈的動脈。但也有2條動脈并存的 情況，如起源于腹腔動脈和起源于胃左動脈(25%)，起源于腹腔動脈和起源于腸系臘上動 脈(10%)，而起源于胃左動脈和起源于腸系膜上動脈的2條動脈同時存在的情況比較少見。 此外，還有5%像胚胎期一樣，3條動脈同時存在。這種起源于腹腔動脈以外的肝動脈稱為 迷走肝動脈，如果肝臟沒有起源于腹腔動脈的動脈供血時，此種異位起源的肝動脈稱替代 動脈，如果在常見肝動脈類型外，還有一支這種異位起始的動脈肝臟的一部分血流， 這種肝動脈稱副肝動脈。肝動脈內(nèi)皮細胞是襯于肝動脈內(nèi)表面的單層扁平上皮，在炎癥時 高表達黏附分子，與血流中白細胞表面黏附分子相互作用，從而介導(dǎo)白細胞穿越血管壁， 亦屬一類非專職抗原提呈細胞。它們吞噬異物、細菌、壞死和衰老的組織，還參與集體免 疫活動，包括：①血管收縮及血管舒張，從而控制血壓；②凝血(血栓形成及纖維蛋白溶 解)；③動脈硬化；④血管生成；⑤炎癥及腫脹(浮腫)；⑥內(nèi)皮細胞亦控制一些物質(zhì)，如白 血球進出血管。
原代細胞分離培養(yǎng)的思路：

取材--分離--培養(yǎng)--鑒定

首先將組織從機體中取出，經(jīng)胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細胞，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞繁殖到一定系數(shù)后進行細胞鑒定。

實驗步驟：

一、取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二、在超凈工作臺中，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中。

四、用細解剖鑷去除大腦白質(zhì)、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質(zhì)。

五、大腦皮質(zhì)放于DMEM中，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。

六、室溫1 000×g離心8min，去上清液。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g，20min，4℃離心，去上清。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min，去上清液。

九、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃離心10min。

十、靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm，6min，室溫)，去上清液。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS，4ug/ml素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含素的混合培養(yǎng)基，隨后隔天換液。

注意事項：

1. 培養(yǎng)基于4℃條件下可保存3-6個月。

2. 在細胞培養(yǎng)過程中，請注意保持無菌操作。

3. 傳代培養(yǎng)過程中，yi酶消化時間不宜過長，否則會影響細胞貼壁及其生長狀態(tài)。

4. 建議客戶收到細胞后前3天每個倍數(shù)各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài)，便于和技術(shù)部溝通；由于運輸?shù)脑颍瑐€別敏感細胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，詳盡告知細胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤、回訪直至問題得到解決。
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