人T淋巴細(xì)胞

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人T淋巴細(xì)胞

培養(yǎng)基：原代T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系

傳代特性：根據(jù)細(xì)胞特性傳代

消化液：0.25%胰dan白酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣 ，95%；  CO2 ，  5%

細(xì)胞簡(jiǎn)介：T淋巴細(xì)胞來(lái)源于骨髓的多能干細(xì)胞 ，  骨髓中的一部分多能干細(xì)胞或前T細(xì)胞遷移  到胸腺內(nèi) ，在胸腺激素的誘導(dǎo)下分化成熟 ，成為具有免疫活性的T細(xì)胞。T細(xì)胞是  相當(dāng)復(fù)雜的不均一體、又不斷在體內(nèi)更新、在同一時(shí)間可以存在不同發(fā)育階段或  功能的亞群 ，按免疫應(yīng)答中的功能不同 ，可將T細(xì)胞分成若干亞群：輔助性T細(xì)胞   ( Helper T cells,Th)  、抑制性T細(xì)胞  ( Suppressor T cells,Ts)  、效應(yīng)T細(xì)胞  ( E ffector T cells,Te)  、細(xì)胞毒性T細(xì)胞  ( Cytotoxic T cells,Tc)  、遲發(fā)反應(yīng) T細(xì)胞  ( Delayed type hypersensitivityT cells,Td)  、放大T細(xì)胞  (Ta)  ，  、原始 的或天然T細(xì)胞  ( Naive T cells)  、記憶T細(xì)胞  ( Memory T cell,Tm)  。

T細(xì)胞是淋巴細(xì)胞的主要組分 ，它具有多種生物學(xué)功能 ，如直接殺傷靶細(xì)胞 ，輔助 或抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體 ，對(duì)特異性抗原和促有絲分裂原的應(yīng)答反應(yīng)以及產(chǎn)生細(xì)胞因 子等 ，T細(xì)胞產(chǎn)生的免疫應(yīng)答是細(xì)胞免疫 ，細(xì)胞免疫的效應(yīng)形式主要有兩種：與靶 細(xì)胞特異性結(jié)合 ，破壞靶細(xì)胞膜 ，直接殺傷靶細(xì)胞；另一種是釋放淋巴因子 ，最  終使免疫效應(yīng)擴(kuò)大和增強(qiáng)。
一、細(xì)胞基本屬性

原代細(xì)胞分離培養(yǎng)的思路：

取材--分離--培養(yǎng)--鑒定

首先將組織從機(jī)體中取出，經(jīng)胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細(xì)胞，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞繁殖到一定系數(shù)后進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

實(shí)驗(yàn)步驟：

一、取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二、在超凈工作臺(tái)中，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開(kāi)顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動(dòng)以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中。

四、用細(xì)解剖鑷去除大腦白質(zhì)、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質(zhì)。

五、大腦皮質(zhì)放于DMEM中，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。

六、室溫1 000×g離心8min，去上清液。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g，20min，4℃離心，去上清。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min，去上清液。

九、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃離心10min。

十、靠近底部的紅細(xì)胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm，6min，室溫)，去上清液。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS，4ug/ml素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過(guò)夜所制備的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含素的混合培養(yǎng)基，隨后隔天換液。

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注意事項(xiàng)：

1. 培養(yǎng)基于4℃條件下可保存3-6個(gè)月。

2. 在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，請(qǐng)注意保持無(wú)菌操作。

3. 傳代培養(yǎng)過(guò)程中，yi酶消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)影響細(xì)胞貼壁及其生長(zhǎng)狀態(tài)。

4. 建議客戶收到細(xì)胞后前3天每個(gè)倍數(shù)各拍幾張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于和技術(shù)部溝通；由于運(yùn)輸?shù)脑?，個(gè)別敏感細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系，詳盡告知細(xì)胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤、回訪直至問(wèn)題得到解決。