大鼠前列腺成纖維細(xì)胞

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大鼠前列腺成纖維細(xì)胞

一、細(xì)胞基本屬性

 

培養(yǎng)基：含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

傳代特性：可傳5代左右；3代以內(nèi)狀態(tài)佳

消化液：0.25%胰dan白酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

傳代比例：1:2

細(xì)胞簡介：大鼠前列腺成纖維細(xì)胞分離自前列腺組織；前列腺(Prostate)是雄性的性腺器官；前列腺是不成對的實質(zhì)性器宮，由腺組織和肌組織構(gòu)成。前列腺如栗子，底朝上，與膀胱相貼，尖朝下，抵泌尿生殖膈，前面貼恥骨聯(lián)合，后面依直腸。前列腺腺體的中間有尿道穿過，扼守著尿道上口，所以，前列腺有問題時，排尿首先受影響。前列腺是機(jī)體非常少有的，具有內(nèi)、外雙重分泌功能的性分泌腺。作為外分泌腺，前列腺每天分泌前列腺液，是構(gòu)成精液主要成分；作為內(nèi)分泌腺，前列腺分泌的激素稱為“前列腺素"。成纖維細(xì)胞(Fibroblast)是疏松結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分，由胚胎時期的間充質(zhì)細(xì)胞分化而來。成纖維細(xì)胞較大，輪廓清楚，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結(jié)構(gòu)，其細(xì)胞核呈規(guī)則的卵圓形，核仁大而明顯。成纖維細(xì)胞功能活動旺盛，細(xì)胞質(zhì)嗜弱堿性，具明顯的蛋白質(zhì)合成和分泌活動，在一定條件下，它可以實現(xiàn)跟纖維細(xì)胞的互相轉(zhuǎn)化；成纖維細(xì)胞對不同程度的細(xì)胞變性、壞死和組織缺損的修復(fù)有著十分重要的作用。剛分離的前列腺成纖維細(xì)胞呈圓形、折光性良好，懸浮于培養(yǎng)基中。30min細(xì)胞貼壁，其中部分開始伸出偽足，表現(xiàn)為小的突起；6h后細(xì)胞基本貼壁，伸展成梭形，胞核清晰，分布較均勻，散在生長，不聚集成團(tuán)；細(xì)胞生長迅速，5-7天即呈融合狀態(tài)，細(xì)胞排列緊密，有的交叉重疊生長，平坦、胞體較大，細(xì)胞質(zhì)透明，細(xì)胞核較大，呈橢圓形，顏色淡。細(xì)胞融合，并彼此連接成網(wǎng)狀；細(xì)胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布。
原代細(xì)胞分離培養(yǎng)的思路：

取材--分離--培養(yǎng)--鑒定

首先將組織從機(jī)體中取出，經(jīng)胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細(xì)胞，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞繁殖到一定系數(shù)后進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

實驗步驟：

一、取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二、在超凈工作臺中，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中。

四、用細(xì)解剖鑷去除大腦白質(zhì)、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質(zhì)。

五、大腦皮質(zhì)放于DMEM中，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。

六、室溫1 000×g離心8min，去上清液。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g，20min，4℃離心，去上清。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min，去上清液。

九、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃離心10min。

十、靠近底部的紅細(xì)胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm，6min，室溫)，去上清液。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS，4ug/ml素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含素的混合培養(yǎng)基，隨后隔天換液。

注意事項：

1. 培養(yǎng)基于4℃條件下可保存3-6個月。

2. 在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，請注意保持無菌操作。

3. 傳代培養(yǎng)過程中，yi酶消化時間不宜過長，否則會影響細(xì)胞貼壁及其生長狀態(tài)。

4. 建議客戶收到細(xì)胞后前3天每個倍數(shù)各拍幾張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于和技術(shù)部溝通；由于運(yùn)輸?shù)脑颍瑐€別敏感細(xì)胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，詳盡告知細(xì)胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤、回訪直至問題得到解決。
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