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進(jìn)口elisa試劑盒檢測(cè)原理

閱讀:266          發(fā)布時(shí)間:2018-7-18

進(jìn)口elisa試劑盒檢測(cè)原理:
本試劑盒采用酶譜法(Zymography)檢測(cè)MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一種廣為使用的、基于SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測(cè)方法,其靈敏度可達(dá)1 nM,高于ELISA方法,其基本原理和程序是:制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE 凝膠,含蛋白酶的樣品在此凝膠中進(jìn)行電泳,電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應(yīng)Buffer 孵育,凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深染,形成深色背景,但在有蛋白酶條帶的位置,蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白,因而不被染色而形成透亮區(qū)域,從而能同時(shí)指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學(xué)反應(yīng)緩沖液,可檢測(cè)少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶譜及活性,檢測(cè)靈敏度~1nM。試劑盒可進(jìn)行50次標(biāo)準(zhǔn)小膠檢測(cè),如果小膠加樣孔為10~15個(gè),則總計(jì)可檢測(cè)500~750個(gè)樣品。
檢測(cè)步驟:
5.1 制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠:推薦分離膠濃度為8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備SDS PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化,并90 ºC 加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍,混勻后加入過(guò)硫酸銨和TEMED,等待凝膠聚合。
5.2 待測(cè)樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制:4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),混合后直接上樣。切勿加熱變性,并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液。可通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定加樣量,使用普通蛋白預(yù)染Marker 即可。
陽(yáng)性對(duì)照(可選步驟):可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合,取5-15μl 上樣。

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