犬用干細(xì)胞分泌因子注射劑的制作方法

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種犬干細(xì)胞注射劑的制備方法及其應(yīng)用。該犬干細(xì)胞注射劑在治療犬貧血、犬白細(xì)胞減少癥、犬非感染性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、肝功能損傷、腎功能損傷、糖尿病、犬退行性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)軟骨缺損等疾病具有*優(yōu)勢，顯著縮短療程，提高患犬生活質(zhì)量且無任何副作用，同時(shí)對于體質(zhì)衰弱的老年犬也具有增強(qiáng)體質(zhì)和抗病力的作用。

本發(fā)明犬用干細(xì)胞分泌因子注射劑，其特征在于其注射劑中含有犬干細(xì)胞分泌因子原液，該原液由A液和B液按3:1的體積比混合而成；其中，A液為犬干細(xì)胞裂解液，B液為犬MSCs和HSCs無血清培養(yǎng)上清液融化、混合、低溫分離、超濾和濃縮后形成。

所述的犬用干細(xì)胞分泌因子注射劑，其特征在于犬干細(xì)胞分泌因子原液中，按質(zhì)量，加入原液0.5%-1%的甘氨酸，0.2%-0.5%的黃芪多糖，0.3%-0.6%的香菇多糖。

所述的犬用干細(xì)胞分泌因子注射劑，其特征在于按質(zhì)量，加入原液0.15%-0.2%的甲鈷胺，0.3-0.5%的維生素B1，0.05-0.1%的維生素B12。

所述的犬干細(xì)胞分泌因子注射劑是注射液或是注射用凍干粉。

所述的犬干細(xì)胞分泌因子注射用凍干粉是用真空冷凍干燥機(jī)經(jīng)真空濃縮、噴霧干燥，得到犬干細(xì)胞分泌因子凍干粉。使用時(shí)注射用生理鹽水進(jìn)行稀釋，每100ml生理鹽水中添加犬干細(xì)胞分泌因子注射用凍干粉80mg。

所述的犬用干細(xì)胞分泌因子注射劑，其特征在于該犬干細(xì)胞分泌因子原液是通過以下步驟制備而得：

（1）犬干細(xì)胞裂解液的制備：將體外培養(yǎng)獲得的MSCs和HSCs混合密封于凍存管中，經(jīng)超低溫液氮反復(fù)凍融至細(xì)胞破碎，再經(jīng)中空纖維超濾柱超濾，再用濾膜過濾，使其無菌，測定蛋白濃度，調(diào)整濃度為0.5mg/ml，標(biāo)記為A液；

（2）將收集后的犬MSCs和HSCs無血清培養(yǎng)上清液融化、混合、低溫分離、超濾和濃縮；利用超濾膜過濾濃縮，再經(jīng)中空纖維超濾柱超濾，將超濾后的液體進(jìn)行濃縮，用濾膜過濾，使其無菌，測定蛋白濃度，定濃度為0.5mg/ml，4℃保存，標(biāo)記為B液；

（3）將上述A液和B液按3：1的體積比混合，得到犬干細(xì)胞分泌因子原液。

本發(fā)明的犬干細(xì)胞分泌因子注射液或凍干粉既可以靜脈滴注，也可以局部注射，如脊髓穿刺或關(guān)節(jié)腔注射。將本發(fā)明的犬干細(xì)胞分泌因子注射液或凍干粉在全國試點(diǎn)寵物醫(yī)院進(jìn)行推廣試用，應(yīng)用在犬貧血、犬白細(xì)胞減少癥、犬非感染性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、肝功能損傷、腎功能損傷、糖尿病、犬退行性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)軟骨缺損等疾病的治療，等300余例進(jìn)行治療，相對于常規(guī)治療，本發(fā)明的犬干細(xì)胞分泌因子注射液/凍干粉*明顯上升，生活質(zhì)量顯著提高；所有病例未出現(xiàn)任何不適癥狀，無毒副作用，安全性好。

具體實(shí)施方式：

實(shí)施例1：犬用干細(xì)胞分泌因子注射液，通過以下的方法制備：

1、在本發(fā)明中所述的MSCs包括從犬骨髓、脂肪、臍帶或胎盤中分離培養(yǎng)的犬間充質(zhì)干細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)鑒定干細(xì)胞表面分子CD44陽性，CD34陰性。所述的HSCs包括從犬骨髓、臍帶血、胎盤中分離培養(yǎng)的犬造血干細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)鑒定干細(xì)胞表面分子CD34陽性，CD44陰性。中國專li申請?zhí)?01410405353.X，公開號(hào)104152409A，以骨髓為來源，公開了犬MSCs和HSCs的獲得方法。

2、用無血清培養(yǎng)液對MSCs和HSCs進(jìn)行培養(yǎng)，每六天對培養(yǎng)MSCs的上清液進(jìn)行半量換液，收集培養(yǎng)后的上清液，測定干細(xì)胞分泌因子的各種成份和活性，濃縮后即為干細(xì)胞分泌因子。

3、制備犬干細(xì)胞分泌因子原液

（1）犬干細(xì)胞裂解液的制備：將體外培養(yǎng)獲得的MSCs濃度調(diào)整為1×107個(gè)/ml，HSCs濃度調(diào)整為1×107個(gè)/ml，各取0.5ml混合密封于凍存管中，經(jīng)超低溫液氮反復(fù)凍融5－7次至細(xì)胞破碎，再經(jīng)截留分子量為50KD中空纖維超濾柱超濾，便可獲得高純度的干細(xì)胞內(nèi)生物活性物質(zhì)群或組合物即為MSCs裂解液；用孔徑為0.22 µm的濾膜過濾，使其無菌，測定蛋白濃度，調(diào)整濃度為0.5mg/ml，標(biāo)記為A液。

（2）將收集后的犬MSCs和HSCs無血清培養(yǎng)上清液融化、混合、低溫分離、超濾和濃縮；超濾和濃縮的處理方法為：利用3K的超濾膜過濾，體積濃縮 1/10，保留生物活性物質(zhì)，再經(jīng)截留分子量為50KD中空纖維超濾柱超濾，將超濾后的液體進(jìn)行濃縮，即可得到含有豐富干細(xì)胞生物活性因子的組合物；用孔徑為0.22 µm的濾膜過濾，使其無菌，測定蛋白濃度，定濃度為0.5mg/ml，4℃保存，標(biāo)記為B液。將上述30 ml的A液和10 ml的B液混合，得到犬干細(xì)胞分泌因子原液。

（3）將步驟（2）得到的犬干細(xì)胞分泌因子原液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，分析結(jié)果顯示于圖1中。

（4）將步驟（3）中各蛋白條帶按分子量大小分別運(yùn)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)檢測，結(jié)果如圖2，圖3，圖4所示，表明成功獲得了具有多種活性因子成份的犬干細(xì)胞分泌因子原液。

4、干細(xì)胞分泌因子注射液的制備

將所獲得的犬干細(xì)胞分泌因子原液中，加入原液質(zhì)量0.5%-1%的甘氨酸，其目的是清除機(jī)體內(nèi)自由基，促進(jìn)干細(xì)胞分泌因子的旁分泌作用。加入原液質(zhì)量0.2%-0.5%的黃芪多糖，加入原液質(zhì)量0.3%-0.6%的香菇多糖，以延長干細(xì)胞分泌因子的持續(xù)作用時(shí)間，同時(shí)增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫功能。

5、用NaHCO3調(diào)整干細(xì)胞分泌因子注射液pH值為7.2-7.5。

實(shí)施例2：用于治療犬非感染性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的犬干細(xì)胞分泌因子注射液，則在犬干細(xì)胞分泌因子原液中加入原液質(zhì)量0.15%-0.2%的甲鈷胺，加入原液質(zhì)量0.3-0.5%的維生素B1，加入原液質(zhì)量0.05-0.1%的維生素B12，以提供營養(yǎng)神經(jīng)的活性物質(zhì)，增強(qiáng)干細(xì)胞分泌因子調(diào)動(dòng)神經(jīng)干細(xì)胞到受損的神經(jīng)部位進(jìn)行修復(fù)。其他制備步驟與實(shí)施例1相同。

實(shí)施例3：犬用干細(xì)胞分泌因子注射用凍干粉，是將實(shí)施例1的注射液用真空冷凍干燥機(jī)經(jīng)真空濃縮、噴霧干燥，得到犬干細(xì)胞分泌因子凍干粉。使用時(shí)注射用生理鹽水進(jìn)行稀釋，每100ml生理鹽水中添加犬干細(xì)胞分泌因子注射用凍干粉80mg

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對犬干細(xì)胞分泌因子注射液/凍干粉做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。