逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR原理:

提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。

逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR操作步驟：

一、RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA（反應(yīng)體系要20ul）依次加入

1、Oligo（dT）加入1ul。

2、RNA（體積即上一步驟計(jì)算出來(lái)的）

3、剩下的用無(wú)Rnase水補(bǔ)齊共12ul 65℃水浴5min。

二、加入逆轉(zhuǎn)錄試劑

1、5×Reaction Buffer                4ul

2、Ribolock RNase Inhibiter     1ul

3、10mM Dntp  mix                   2ul

4、RevertAid m-mul URT          1ul

三、設(shè)置儀器，按照說(shuō)明書設(shè)置

1、oligodT：42℃  60min

2、逆轉(zhuǎn)錄：70℃  5min

3、終止：4℃

附加：cDNA可以跑電泳看一下，取cDNA 1ul加load buffer（看這個(gè)是幾乘的）混勻，跑電泳，marker用2000的取6ul左右膠板的制作，后面有說(shuō)明。

四、PCR cDNA擴(kuò)增目的基因（反應(yīng)體系是20ul，不夠用無(wú)菌水補(bǔ)齊）

下面的實(shí)驗(yàn)用高壓過(guò)的槍頭和普通高壓過(guò)的水即可。（所用以下配比物品都要在冰箱中凍存，使用之前離心，甩下來(lái)即可。量大的話可以先加樣配比，即把所需要的試劑總量計(jì)算出后，取出放在ep管中。）

1、加樣：①M(fèi)ix 10ul   ②引物 1ul    ③cDNA和水總計(jì)9ul

2、混勻：小離心機(jī)甩一下即可

3、放入PCR儀：PCR儀事先設(shè)定條件，反應(yīng)條件根據(jù)mix說(shuō)明書來(lái)設(shè)定

4、PCR產(chǎn)物保存：一般在4℃冰箱保存，長(zhǎng)時(shí)間不用可-20℃凍存。

五、配膠和跑膠:

1、配膠: （水平膠；瓊脂糖凝膠）要帶手套，TAE有毒。

小膠板8孔的  TAE 25ml 瓊脂糖 0.25～0.30g

中膠板25孔的 TAE 50ml 瓊脂糖 0.50～0.55g

步驟：稱取BIOWEST AGAROSE（瓊脂糖）放入配膠專用燒瓶→用配膠專用量筒量1×TAE倒入燒瓶→酒精燈加熱(以看到冒泡為準(zhǔn))→將沸騰的液體轉(zhuǎn)移到EB污染區(qū)的燒瓶中→加入EB或EB替代（觀察顏色不是很深即可，一般小膠板3滴左右）→插梳子→倒入電泳槽(倒膠從一個(gè)角倒入防止產(chǎn)生氣泡)→待膠凝固30分鐘左右拔出梳子進(jìn)行跑膠(如不馬上跑將膠放4℃冰箱保存,防止膠變干)。

2、跑膠:

（1）電泳緩沖液用1×TAE,一般跑5-8次膠后就要重新?lián)Q電泳緩沖液。

（2）要讓緩沖液沒(méi)過(guò)膠。

（3）Marker標(biāo)記染色體上一個(gè)可以被識(shí)別的區(qū)域，我們用的是2000的（保存在4℃冰箱中）：3-6ul單格加入。

步驟：取PCR產(chǎn)物（cDNA）8ul，加入單格上，接通電源，跑膠。（注意：跑膠方向是從負(fù)極到正極）,當(dāng)loading Buffer跑到2/3時(shí)停止跑膠（大約40分鐘），帶手套取膠放在照相臺(tái)上。

六、照相