實時熒光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）通過對PCR擴增反應中的每一個循環(huán)產物熒光信號的實時監(jiān)測從而實現對起始模板的定性及定量分析。

 

1.在qPCR 技術中重要的參數指標有哪些？

   擴增及溶解曲線：擴增曲線是PCR過程中，以循環(huán)數為橫坐標，以熒光強度為縱坐標所繪制的曲線。主要用于反映qPCR的動態(tài)進程；溶解曲線是用來驗證擴增產物特異性的，如果產物是單一條帶，溶解曲線就會出現單峰，如果有引物二聚體或其它非特異性擴增，就會出現至少兩個峰。

 

  熒光域值（threshold）: 是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意位置上，但一般熒光域值的缺省設置是PCR反應前3-15個循環(huán)熒光信號標準偏差的10倍，即：threshold。

 

  Ct 值：是指每個反應管內的熒光信號到達設定域值時所經歷的循環(huán)數。將已知濃度的標準品梯度稀釋進行qPCR，按照起始DNA量由多到少的順序等間隔得到一系列擴增曲線。Ct值與起始模板數的對數值之間存在線性關系，可以制作標準曲線。未知濃度的樣品也得到Ct值，代入標準曲線，就可以求出未知樣品的起始模板量。

2.擴增曲線一般分為哪幾個階段：

  熒光擴增曲線一般分為基線期、指數增長期和平臺期。在qPCR擴增早期，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產物量的變化，此時即為基線期，

 

PCR反應過程中產生的DNA拷貝數是呈指數形式增加的，隨著反應循環(huán)數的增加，zui終PCR反應不再以指數形式生成模板，從而進入平臺期，在該時期，擴增產物已不再呈指數級的增加，PCR的終產物量與起始模板量之間無線性關系，只有在熒光信號的指數增長期，PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，可以選擇在這個階段進行定量分析。

3.ROX染料的作用

ROX（Passive Reference Dye）是一種惰性參比染料，在qPCR反應中能被qPCR儀檢測到。ROX不參與qPCR反應，熒光信號值不會隨著qPCR擴增而改變。實驗過程中很多因素會引起孔間差異：不均勻的照明，孔與孔之間光學因素（液滴、氣泡）的因素，反應體系的濃度不同…… 可以用ROX作為陽性參比，對其他熒光信號進行歸一化校正，以提高數據的較精確度。

 

4.Ct值多少才算理想

一般來說Ct值在30以下都可以說實驗結果是可靠的，30以上基本可以說明該基因沒有擴增，但也不是的，需要輔以溶解曲線加以解釋。