qPCR實驗中，引物設(shè)計也是非常重要的一個環(huán)節(jié)，引物的合適與否與擴(kuò)增效率是否達(dá)標(biāo)、擴(kuò)增產(chǎn)物是否特異、實驗結(jié)果是否可用等息息相關(guān)。

設(shè)計qPCR引物時，通常要留意以下幾點：引物盡量要跨內(nèi)含子設(shè)計、產(chǎn)物長度100~300 bp、Tm值盡量接近60℃且上下游引物盡量接近、引物末端最好是G或C等等。

1. 引物跨內(nèi)含子設(shè)計

在設(shè)計qPCR引物時，選擇跨內(nèi)含子設(shè)計的引物可以使gDNA模板不能得到擴(kuò)增，產(chǎn)物均來源于cDNA的擴(kuò)增，這樣也就去除了gDNA污染造成的影響。

2. 引物長度

引物長度一般在18~30 nt之間，擴(kuò)增產(chǎn)物長度盡量控制在 100~300 bp之間。

引物設(shè)計太短會導(dǎo)致非特異擴(kuò)增，太長則容易形成二級結(jié)構(gòu)(如發(fā)夾結(jié)構(gòu))。擴(kuò)增產(chǎn)物太長不適于聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，會影響到PCR擴(kuò)增效率。

3. GC含量和Tm值

引物GC含量控制在40%~60%之間，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。正反向引物GC含量應(yīng)接近相同，以便獲得相同的 Tm值和退火溫度。

Tm值應(yīng)盡量在55~65℃之間，一般為60℃左右，上下游的Tm值應(yīng)盡量姐接近，最好不超過4℃。

4. 引物3′端末端避免選擇A

引物3′端錯配時，不同堿基引發(fā)合成效率存在著很大的差異，當(dāng)末位堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能引發(fā)鏈合成，而當(dāng)末位為T時，錯配引發(fā)效率大大降低。因此引物3’端盡量避免選擇A，最好選擇T。

若為探針引物，則探針5’端不能為G，因為即使單個G堿基與FAM熒光報告基團(tuán)相連時，G也可以淬滅FAM基團(tuán)所發(fā)出的熒光信號，從而導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)。

5. 堿基分布

引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，3′端避免超過3個連續(xù)的G或C，3個以上連續(xù)的G或C容易在GC富集序列區(qū)產(chǎn)生配對。

6. 引物設(shè)計區(qū)域應(yīng)避開復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)。

擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈形成二級結(jié)構(gòu)會影響PCR順利進(jìn)行，可通過提前預(yù)測靶序列是否存在二級結(jié)構(gòu)，盡量避開該區(qū)域設(shè)計引物。

7. 引物自身和引物之間應(yīng)盡量避免堿基連續(xù)互補(bǔ)。

引物自身和引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則會自身折疊形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。

上下游引物之間也不能存在互補(bǔ)序列，引物之間互補(bǔ)會產(chǎn)生引物二聚體而降低PCR效率甚至影響定量準(zhǔn)確性。如果引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)不可避免，應(yīng)盡量使其△G值不要過高（應(yīng)小于4.5 kcal/mol）。

8. 引物擴(kuò)增的是目標(biāo)特異產(chǎn)物。

qPCR檢測最終目的是了解目的基因的豐度，如果出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，定量會不準(zhǔn)確。所以設(shè)計好引物后，需要對其進(jìn)行BLAST檢測，在序列數(shù)據(jù)庫中比對產(chǎn)物的特異性。