聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction簡稱PCR）基因擴(kuò)增技術(shù)又稱無細(xì)胞分子克隆系統(tǒng)或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增法，是基因擴(kuò)增技術(shù)的一次重大革新。可將極微量的靶DNA特異地?cái)U(kuò)增上百萬倍，從而大大提高對(duì)DNA分子的分析和檢測能力，能檢測單分子DNA或?qū)γ?span style="font-family:Calibri;box-sizing: border-box;">10萬個(gè)細(xì)胞中僅含1個(gè)靶DNA分子的樣品，因而此方法立即在分子生物學(xué)、微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及遺傳學(xué)等多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用和迅速發(fā)展。由于PCR具有敏感性高、特異性強(qiáng)、快速、簡便等優(yōu)點(diǎn)，已在病原微生物學(xué)領(lǐng)域中顯示出巨大的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的發(fā)展前景。

    PCR技術(shù)是由Cetus公司和加利福尼亞大學(xué)1985年聯(lián)合創(chuàng)造的，主要貢獻(xiàn)者為Kary B mulis和HeneryA、Erlich。該方法首先被應(yīng)用于人β-珠蛋白DNA的擴(kuò)增及鐮刀狀紅細(xì)胞貧血病的產(chǎn)前診斷。自85年第1次報(bào)道PCR方法以來，PCR被廣泛應(yīng)用于分子克隆、序列分析、基因突變、遺傳病、傳染病、性傳播性疾病及法醫(yī)判定和考古研究等多領(lǐng)域、并發(fā)揮了越來越大的作用。因而發(fā)明人Kary B、mulis獲1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。
為了使PCR技術(shù)在臨床上迅速得以普及，我們對(duì)該技術(shù)的某些程序成功地作了重大改革，使PCR技術(shù)變得簡單、微量化、不易發(fā)生污染，從而使PCR技術(shù)常規(guī)化成為可能。

一、PCR技術(shù)的特點(diǎn):
1、特異性高
　　報(bào)導(dǎo)的PCR所用的DNA聚合酶是大腸桿菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段，其酶活性在90℃會(huì)變性失活，需每次PCR循環(huán)都要重新加入Klenow大片段，同時(shí)引物是在37℃延伸（聚合）易產(chǎn)生模板—引物之間的堿基錯(cuò)配、致特異性較差，1988年Saiki等從溫泉水中分離到的水生嗜熱桿菌中提取的熱穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，在熱變性處理時(shí)不被滅活，不必在每次循環(huán)擴(kuò)增中再加入新酶，可以在較高溫度下連續(xù)反應(yīng)，顯著地提高PCR產(chǎn)物的特異性，序列分析證明其擴(kuò)增的DNA序列與原模板DNA一致。擴(kuò)增過程中，單核苷酸的錯(cuò)誤參入程度很低、其錯(cuò)配率一般只有約萬分之一，足可以提供特異性分析，選用各型病毒相對(duì)的特異寡核苷酸引物。PCR能一次確定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物檢測病婦宮頸刮片細(xì)胞可以發(fā)現(xiàn)部分病人存在HPV11和HPV16兩型的雙重感染。
2、高度敏感
　　理論上PCR可以按2n倍數(shù)擴(kuò)增DNA十億倍以上，實(shí)際應(yīng)用已證實(shí)可以將極微量的靶DNA成百萬倍以上地?cái)U(kuò)增到足夠檢測分析量的DNA。能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞，或?qū)χT如病人口液等只含一個(gè)感染細(xì)胞的標(biāo)本或僅含0.01pg的感染細(xì)胞的特異性片段樣品中均可檢測。
3、快速及無放射性
　　一般在2小時(shí)內(nèi)約可完成30次以上的循環(huán)擴(kuò)增，加上用電泳分析。只需3-4小時(shí)便可完成，不用分離提純病毒，DNA粗制品及總RNA均可作為反應(yīng)起始物，可直接用臨床標(biāo)本如血液、體液、尿液、洗液、脫落毛發(fā)、細(xì)胞、活體組織等粗制的DNA的提取液來擴(kuò)增檢測，省去費(fèi)時(shí)繁雜的提純程序，擴(kuò)增產(chǎn)物用一般電泳分析即可，不一定用同位素，無放射性易于推廣。
4、簡便
　　擴(kuò)增產(chǎn)物可直接供作序列分析和分子克隆，擺脫繁瑣的基因方法，可直接從RNA或染色體DNA中或部分DNA已降解的樣品中分離目的基因，省去常規(guī)方法中須先進(jìn)行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的組織或切片亦可檢測。如在PCR引物端事先構(gòu)建一個(gè)內(nèi)切酶位點(diǎn)，擴(kuò)增的靶DNA可直接克隆到M13，PUC19等相應(yīng)酶切位點(diǎn)的載體中。
5、可擴(kuò)增RNA或cDNA
　　先按通常方法用寡脫氧胸苷引物和逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA轉(zhuǎn)變成單鏈cDNA，再將得到的單鏈cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即使mRNA轉(zhuǎn)錄片段只有100ngcDNA中的0.01%，也能經(jīng)PCR擴(kuò)增1ng有242堿基對(duì)長度的特異片段，有些外顯子分散在一段很長的DNA中，難以將整段DNA大分子擴(kuò)增和做序列分析。若以mRNA作模板，則可將外顯子集中，用PCR一次便完成對(duì)外顯子的擴(kuò)增并進(jìn)行序列分析。

二、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析法
    PCR擴(kuò)增DNA片段只是一個(gè)重要手段。擴(kuò)增片段的檢測和分析才是目的，根據(jù)研究對(duì)象和目的的不同而采用不同的分析法。瓊脂糖凝膠電泳可幫助判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，有助于擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定，點(diǎn)雜交除可鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物外，還有助于產(chǎn)物的分型；Southern雜交分析可從非特異擴(kuò)增產(chǎn)物中鑒定出特異產(chǎn)物的大小，增加檢測的特異性與敏感性，最近發(fā)展的一系列產(chǎn)物分析法（PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等）均有助于產(chǎn)物的精確分析。
1、凝膠電泳分析法
PCR產(chǎn)物可通過瓊脂糖凝膠或聚丙xi酰胺凝膠電泳檢測，以前者常用，通過電泳可以判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。在臨床檢測中，僅通過凝膠電泳判斷擴(kuò)增片段大小即可滿足檢測的需要。通常制膠方法為100mlTBE加1.5g瓊脂糖在微波鍋內(nèi)溶解，稍冷后倒入電泳槽。
　　電泳后，用溴化乙淀染色20min，然后用去離子水漂洗2次，每次15min，于UV燈下觀察結(jié)果并拍照。
　　凝膠電泳不僅可以鑒定產(chǎn)物的大小，檢測擴(kuò)增的情況，還可以用來純化擴(kuò)增產(chǎn)物。
2、點(diǎn)雜交
　　當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物是多條帶時(shí)，用點(diǎn)雜交更合適。這種方法的基本過程是，首先將擴(kuò)增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，再用放射性或非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的探針雜交。點(diǎn)雜交還有助于檢測突變DNA的突變類型，用于人類遺傳病診斷和某些基因的分型。放射性同位素32P標(biāo)記的寡核苷酸探針檢測的敏感性、特異性和方法的可靠性均不容懷疑，對(duì)人們認(rèn)識(shí)某些疾病與基因變異的關(guān)系起了很大的作用。但是，由于同位素不穩(wěn)定和放射性危害，不能常規(guī)用于臨床或法醫(yī)檢驗(yàn)，用非放射性物質(zhì)（生物素、熒光素和di高辛等）標(biāo)記的寡核苷酸探針分析PCR產(chǎn)物以確定核酸序列變異則是一種簡便而安全的方法。非放射性標(biāo)記物質(zhì)穩(wěn)定性高，使用方便、安全、檢測速度快。
3、微孔板夾心雜交法
　　該法是通過一固定于微孔板的捕獲探針與PCR產(chǎn)物的某一區(qū)域特異雜交使產(chǎn)物間接地固定于微孔板上。然后，再用一生物素等非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的檢測探針與產(chǎn)物的另一區(qū)域雜交，漂洗后顯色即可判斷結(jié)果，該法需要兩個(gè)雜交過程來檢測一個(gè)產(chǎn)物，因此，其特異性較一次雜交的檢測法高。該法已用于HBV的檢測，其敏感度可達(dá)5個(gè)HBv DNA分子。此法的敏感性和特異性與PCR 32P探針的Southern雜交法相當(dāng)。但PCR微孔板夾心雜交法操作簡便、快速、避免了同位素標(biāo)記探針的危害，顯色反應(yīng)類似于臨床常規(guī)應(yīng)用的ELISA,適于臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)應(yīng)用。
4、PCR-ELISA法
　　本法避免了電泳和雜交的步驟，適于常規(guī)ELISA記數(shù)儀檢測。因?yàn)?span style="font-family:Calibri;box-sizing: border-box;">5'端修飾后仍可進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增特異靶序列。因此，可以通過修飾一個(gè)引物的5′端使其攜帶便于PCR產(chǎn)物固定的功能基因，而通過另一引物5′-端的修飾使產(chǎn)物便于檢測。

三、PCR實(shí)驗(yàn)中常見問題對(duì)策
　　所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果都有成功或失敗，實(shí)驗(yàn)的失敗可能是應(yīng)該出結(jié)果而沒有出，我們把它稱作假陰性，不該出結(jié)果而出了結(jié)果我們把它稱為假陽性。PCR實(shí)驗(yàn)中最常見的問題就是假陰性和假陽性問題。
1、假陰性
　　出現(xiàn)假陰性結(jié)果最常見的原因是：Taq DNA聚合酶活力不夠，或活性受到抑制；引物設(shè)計(jì)不合理；提取的模板質(zhì)量或數(shù)量不過關(guān)以及PCR系統(tǒng)欠妥當(dāng)；循環(huán)次數(shù)不夠。所以在實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陰性失敗時(shí)，首先在原來擴(kuò)增的產(chǎn)物中再加入Taq DNA聚合酶、增加5-10次循環(huán)，一般都會(huì)獲得成功。如果沒有成功應(yīng)檢查PCR擴(kuò)增儀的溫度是否準(zhǔn)確，采集標(biāo)本是否有問題。為了防止假陰性的出現(xiàn)在選用Taq DNA聚合酶時(shí)，要注意用活力高質(zhì)量好的酶。同時(shí)在提取PCR模板時(shí)，應(yīng)特別注意防止污染抑制酶活性物質(zhì)（如酚、 lv仿）的存在。盡管Taq DNA聚合酶對(duì)模板純度要求不高，但也不允許有破壞性有機(jī)試劑的污染。PCR擴(kuò)增的先決條件及特異性是引物與靶DNA良好的互補(bǔ)，尤其是要絕對(duì)保證引物的3′端與靶基因的互補(bǔ)。對(duì)變異較大的擴(kuò)增對(duì)象，宜采用巢式（Nested）PCR或double PCR。在進(jìn)行PCR操作時(shí)應(yīng)注意Mg2+的濃度要合理。PCR反應(yīng)的各溫度點(diǎn)的設(shè)置要合理。
2、假陽性
PCR結(jié)果的假陽性是對(duì)被檢測標(biāo)本而言，而反應(yīng)系統(tǒng)中所擴(kuò)增的產(chǎn)物是真實(shí)的。因?yàn)?span style="font-family:Calibri;box-sizing: border-box;">PCR技術(shù)高度靈敏，極其微量的靶基因污染都會(huì)造成大量擴(kuò)增，而造成結(jié)果判斷上的失誤，所以污染是PCR假陽性的主要根源。PCR的污染主要是標(biāo)本間的交叉污染和擴(kuò)增子的污染。出現(xiàn)假陽性結(jié)果的另一種可能是樣品中存在有靶基因的同源序列。為了避免因污染而造成的假陽性，PCR操作時(shí)要隔離不同操作區(qū)、分裝試劑、簡化操作程序，使用一次性吸頭。