2-8℃ 避光

開蓋后組份按要求條件保存。

6個(gè)月

血清血漿/組織/細(xì)胞

1.分光光度計(jì)
2.恒溫水浴鍋
3.漩渦混勻器
4.離心機(jī)
5.移液器
6.冰箱
7.冰盒

1.純水
2.無水乙醇

1.離心管
2.吸頭

1.管子要洗干凈，先用溫肥皂水刷凈，再用自來水沖洗20遍以上，最后用純水過1-2次后烘干即可；
2.試劑B配制時(shí)要加熱充分溶解（溫度可達(dá)90-100℃）；
3.肝素抗凝全血放置冰箱存放時(shí)間不可超過3天，血漿、組織塊放-20℃可保存一個(gè)月；
4.試劑A配成儲(chǔ)備液后，冰箱冷藏至少可保存一個(gè)月；
5.1mmol/L的GSH底物現(xiàn)配現(xiàn)用；
6.上清液當(dāng)天提取當(dāng)天測定；
7.樣品前處理參照實(shí)驗(yàn)方法學(xué)部分；

試劑配制
1. 試劑A1的配制：
使用前將A1粉劑加1ml無水乙醇充分溶解2-8℃保存。
2. 試劑A工作液配制：
使用前將配制好的試劑A1：A2按1:59的比例進(jìn)行配制，現(xiàn)配現(xiàn)用；
3. 試劑B工作液配制：
使用前將粉劑B1加90~100℃的熱純水170ml，充分溶解，將配制好的B1和B2兩種溶液充分混勻，得到的為過飽和溶液，室溫保存；如果出現(xiàn)結(jié)晶，直接取上清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；
4. 試劑C工作液配制：
加純水200ml，充分溶解后，室溫保存；可以保存在贈(zèng)送的塑料瓶中。
5. 試劑D工作液配制：
加純水50ml，充分溶解后，2-8℃避光保存；
6. 試劑F工作液配制：
將試劑F：標(biāo)準(zhǔn)溶劑儲(chǔ)備液：純水=1:9的比例10倍稀釋；
7. 標(biāo)準(zhǔn)品的配制：
1mmol/L的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：取3.07mg的GSH標(biāo)準(zhǔn)品一支加到已配好的試劑F工作液10ml中混勻溶解；
20umol/L的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：取1mmol/L的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2ml加試劑F工作液9.8ml中混勻溶解；
8. 基質(zhì)液的配制：
試劑A工作液與1mmol/L的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液以1:1混合。

操作步驟：；

(一)、樣本前處理
1. 50倍稀釋的溶血液的配制：取肝素抗凝全血20ul，以純水稀釋至1ml，混勻，放置5min進(jìn)行測定；配制好的溶血液要在1小時(shí)內(nèi)測定完，否則影響酶活力；抗凝全血若當(dāng)天來不及測定可冰箱2-8℃保存，2-3天內(nèi)酶活力變化不大；
2. 組織勻漿的制備;
（1）取組織塊（0.2-1g）最少可到2-5mg，在冷的生理鹽水中漂洗，去除血液，擦拭干，稱重，放入5或10ml的小燒杯中；
（2）加入預(yù)冷的勻漿介質(zhì)（ph7.4的0.01mol/L Tris-Hcl，0.0001mol/L EDTA-2Na，0.01mol/L蔗糖0.8%的氯化鈉溶液）或者用0.86%冷生理鹽水，加入的體積總量為組織塊重量的9倍。將組織塊盡可能的剪碎。
（3）機(jī)械勻漿：用組織搗碎機(jī)10000-15000r/min 上下研磨制成10%勻漿。
（4）將制備好的10%勻漿用普通離心機(jī)或低溫低速離心機(jī)3000r/min左右離心10-15min，取上清待測；
3. 線粒體及微粒體的制備：
（1）制備10%組織勻漿（制備方法同上）；
（2）制備線粒體：取10%組織勻漿，用普通離心機(jī)或低溫低速離心機(jī)以1000-2000r/min離心10min，取上清以8000-10000r/min（低溫高速離心機(jī)）離心15min，沉淀即為線粒體；
（3）制備微粒體：取分離線粒體后的上清液，以144000g離心30min，沉淀為即為微粒體；
（4）將分離的線粒體或微粒體分別用冰冷的勻漿介質(zhì)制備成混懸液，機(jī)械或手工勻漿使其破碎，待測酶活力；也可反復(fù)凍融使其破碎，但有部分酶活會(huì)受影響。
4. 血清、血漿可直接取樣；

（二）、血清樣本操作表
計(jì)算公式：
1. 血清GST活力單位定義：
每毫升血清（漿）在37℃的反應(yīng)1min，扣除非酶促反應(yīng)，使反應(yīng)體系中GSH濃
度降低1umol/L為1個(gè)酶活力單位；

2. 計(jì)算公式：

血清（漿）GST活力 = 對(duì)照OD值–測定OD值X 標(biāo)準(zhǔn)品濃度 X 反應(yīng)體系稀釋÷ 反應(yīng)時(shí)間
（U/ml） 標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值 （20umol/L） 倍數(shù)（6倍） （30min）


÷ 樣本取樣量（0.1ml）

（二）、組織樣本操作表
酶促反應(yīng)：
顯色反應(yīng)：
計(jì)算公式：
1. 組織樣本GST活力單位定義：
每毫克組織蛋白在37℃的反應(yīng)1min，扣除非酶促反應(yīng)，使反應(yīng)體系中GSH濃
度降低1umol/L為1個(gè)酶活力單位；

2. 計(jì)算公式：

組織中GST活力 = 對(duì)照OD值–測定OD值X標(biāo)準(zhǔn)品濃度 X反應(yīng)體系稀釋÷反應(yīng)時(shí)間÷取樣量
（U/mgprot） 標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值 （20umol/L） 倍數(shù)（6倍） （10min）（0.1ml）

÷ 待測樣本蛋白濃度
（mgprot/ml）

【注】：mgprot/ml表示蛋白濃度為毫克蛋白/毫升。

（三）50倍稀釋溶血液樣本檢測：
酶促反應(yīng)：
顯色反應(yīng)：

計(jì)算公式：
1. 全血中GST活力單位定義：
每毫升全血在37℃的反應(yīng)1min，扣除非酶促反應(yīng)，使反應(yīng)體系中GSH濃
度降低1umol/L為1個(gè)酶活力單位；

2. 計(jì)算公式：

全血GST活力 = 對(duì)照OD值–測定OD值X 標(biāo)準(zhǔn)品濃度 X 反應(yīng)體系稀釋÷ 反應(yīng)時(shí)間
（U/ml） 標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值 （20umol/L） 倍數(shù)（6倍）（30min）


÷ 全血取樣量（0.004ml）