概述

香蘭素（圖 1）是天然香草的主要成分，是世界范圍內(nèi)使用非常廣泛和非常重要的調(diào)味材料之一。

香蘭素可以從熱帶香草蘭(主要是 Vanilla planifolia Andrews) 1的豆子或豆莢中提取、重組生產(chǎn)或合成。食品配方中使用的純香蘭素的來源可以通過其同位素特征2來區(qū)分。該方法可能需要先進(jìn)行初步純化。

在本研究中，使用香草的乙醇粗提物來對比VERITY® PLC 2050 系統(tǒng)與不同類型色譜柱配合使用的能力。在 HPLC 制備柱和 CPC PRO 上進(jìn)行香蘭素（Vanillin）的制備純化。對比了兩種技術(shù)所獲取最終的香蘭素純度、溶劑消耗和進(jìn)樣量。

離心分配色譜技術(shù)是什么？

它全稱Centrifugal Partition Chromatography, 由Nunogaki發(fā)明，簡稱CPC。CPC屬于現(xiàn)代逆流色譜技術(shù)的一種，它和滴流逆流色譜（DCCC）、旋轉(zhuǎn)腔式逆流色譜（RLCCC）以及回旋腔室逆流色譜（GLCCC）等同屬于非螺旋管式的逆流色譜。

離心分配色譜技術(shù)的原理

和以硅膠顆粒等材質(zhì)作為固定相以及有機(jī)溶劑作為流動相的傳統(tǒng)HPLC色譜有所不同，離心分配色譜技術(shù)的原理和液液萃取相似，都是利用待分離物質(zhì)在兩種互不相溶的有機(jī)溶劑中不同的溶解度作為基礎(chǔ)，將其中一種溶劑作為固定相，另外一種作為流動相。

離心分配色譜的技術(shù)優(yōu)點

離心分配色譜技術(shù)和利用色譜柱的制備色譜相比，其使用成本更低。最大的優(yōu)點就是為用戶節(jié)省了色譜柱這個耗材，CPC利用的是不銹鋼旋轉(zhuǎn)式分離柱，不需要頻繁的更換。CPC技術(shù)在對有機(jī)溶劑的消耗量上也更為節(jié)省，在分離過程中不需要使用大量的流動相來沖洗色譜柱。

由于不使用硅膠顆粒這類較為脆弱的分離介質(zhì)，當(dāng)科學(xué)家采用離心分配色譜儀進(jìn)行目標(biāo)物的制備純化時，待分離的產(chǎn)物無需經(jīng)過前處理就可以直接進(jìn)樣。

CPC技術(shù)可以兼容多肽和蛋白質(zhì)的分離，沒有樣品損失，堅實耐用，可以直接從實驗方法向工業(yè)分離進(jìn)化。

離心分配色譜(CPC)應(yīng)用的優(yōu)勢

• 可從 6.3 g 粗提物獲得 500 mg 的純香蘭素，并進(jìn)一步同位素分析確認(rèn)其特性。

• 制備型高效液相色譜法與離心分離色譜法在香蘭素純化方面的比較。

解決的問題

• 一套制備型液相系統(tǒng) (PLC 2050) 可以同時適應(yīng)制備高效液相色譜法和離心分離色譜法。
• 與制備高效液相色譜相比，離心分離色譜(CPC 250 PRO) 是復(fù)雜提取物處理的更佳選擇。
• 大幅度減少溶劑消耗，降低成本和對環(huán)境的影響

材料和方法

01.系統(tǒng)

純化儀器

圖 2 搭載離心分離色譜儀(左)的 PLC 純化系統(tǒng) (右)

圖 3 裝載制備液相色譜柱的 PLC 2050

Gilson VERITY CPC 250 Pro 離心分配色譜儀(圖2)， 或者 Merck 公司的制備 HPLC 色譜柱 Hibar 250 X25, C18, 5μm (圖3) 連接到 Gilson PLC 2050 系統(tǒng), 該系統(tǒng)配有一臺 50 mL/min 的四元梯度泵，一臺紫外檢測器, 一臺餾分收集器及配套的 Gilson Glider 軟件。

配備波長范圍200-800nm二極管陣列檢測器 (PDA)的HPLC系統(tǒng)

02.樣品

香草的乙醇粗提物首先進(jìn)行 HPLC 分析 (表 1)。香蘭素在 rt = 9.9 分鐘出峰， 280 納米處峰值面積為 63.7%, (圖 4)。

表1 HPLC分析條件

圖 4 粗提物在280nm的HPLC分析色譜圖

通過外標(biāo)對照品校正， 粗提物種中香蘭素的含量約為 9% (w/w) 。提取物中大部分的分子沒有被紫外檢測到。

制備 28 g/L 的香蘭素提取物溶液用于離心分離色譜進(jìn)樣， 同時制備 0.08g/L 的低濃度樣品用于制備HPLC，以避免進(jìn)樣壓力過高。

03.方法

制備高效液相色譜與離心分配色譜所運行的方法分別詳見表 2 和表 3。當(dāng)使用制備高效液相色譜時，進(jìn)樣 90 mg 的粗油， 以 20mL/min 的流速等度洗脫。當(dāng)使用離心分離色譜時，進(jìn)樣 6.3 g 的粗油， 以30mL/min 的升相模式洗脫。

表2 制備液相色譜條件

表3 制備液相色譜條件

將純化后的產(chǎn)物進(jìn)一步進(jìn)行HPLC 分析，在 280nm 下檢測香蘭素。

結(jié)果和討論

最終得到的制備色譜圖如圖 5 和圖 6 所示。兩個色譜圖中的藍(lán)色區(qū)域代表收集的香蘭素餾分。這些餾分進(jìn)一步使用 HPLC 進(jìn)行分析，在 280nm 下的檢測結(jié)果如圖 7 和圖 8 所示。

圖 5 制備色譜在280nm處的紫外色譜圖

圖 6 VERITY CPC 250 PRO在280nm處UV色譜圖

這些餾分進(jìn)一步使用 HPLC 進(jìn)行分析，在 280nm 下的檢測結(jié)果如圖 7 和圖 8 所示。

圖 7 通過制備色譜柱純化，收集的香蘭素餾分合并后，在280nm處HPLC分析圖譜

圖 8 通過VERITY CPC 250 PRO離心分配色譜柱純化，收集的香蘭素餾分合并后，在280nm處HPLC分析圖譜

兩種技術(shù)都能獲得純度大于 99% 的香蘭素（表 4）。此外，使用 CPC 的回收率大于 91.8%（表 4）。這表明 CPC 能夠避免由于潛在的不可逆吸附而導(dǎo)致的樣品損失。

在制備型 HPLC 中洗脫香蘭素需要 500毫升溶劑（圖 5），而在 CPC 中洗脫香蘭素僅需使用 360 毫升溶劑（表 4）。由此可以得出，每進(jìn)樣 1 g的原料，制備型 HPLC 需要使用 5.3 升的溶劑，而 CPC 只需要使用 0.1 升的溶劑。

本研究中由于制備型 HPLC 的進(jìn)樣量低，無法得到回收的香蘭素的質(zhì)量和產(chǎn)率。

表 4 通過制備色譜法和離心分配色譜法對香蘭素進(jìn)行純化的結(jié)果對比

結(jié)論

PLC 2050 能夠高效便捷地與 CPC 和 prep HPLC 色譜柱搭配使用，用來進(jìn)行純化工作。在本文中， 通過對比 CPC 與 HPLC 制備柱，展現(xiàn)了 CPC 的優(yōu)勢（表 4）。與 prepHPLC 相比， CPC 溶劑消耗量更低且無需固定相（如二氧化硅），進(jìn)樣量更大，而純化效率近似。這些基于實驗室級儀器得到的純度，產(chǎn)量，產(chǎn)率等數(shù)據(jù)，可以放大并應(yīng)用到工業(yè)級 CPC （如 Gilson VERITY 工業(yè)級 CPC ）解決方案。

參考文獻(xiàn)：
1.Vanillin; Walton N.J. and Al; Phytochemistry, 63, (2003), 505-515
2.Zietlow et. al. Journal of Agricultural and Food Chemistry 50(22):6271-5