組織研磨儀在豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)樣品方法中的應(yīng)用

豬瘟檢測(cè),主要監(jiān)測(cè)手段是實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,大致流程步驟為:樣品研磨(制備樣品)----磁珠提取(提取DNA,RNA)----結(jié)合試劑盒上實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)。而在樣品研磨過(guò)程中采用新銳精儀組織研磨儀GD200、GD300、GD16都可以很好運(yùn)用到這一環(huán)節(jié)中來(lái)，下面以GD16為例：

1 器材和設(shè)備

1.1組織研磨儀GD16

1.2離心管

1.3 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：大離心力12000g以上

1.4冰箱

1.5 熒光PCR檢測(cè)儀

1.6 微量移液器和吸頭

2 樣品的采集

2.1采樣注意事項(xiàng)

采樣及樣品前處理過(guò)程中應(yīng)戴一次性手套，樣本不得交叉污染。

2.2采樣工具

扁桃體采樣器：鼻捻子、開口器和采樣搶。使用前均應(yīng)用3%氫氧化鈉溶液浸泡5Min~10Min，經(jīng)清水沖洗。

滅菌牙簽和0.5ml或1.5ml離心管經(jīng)（121±2）℃，高壓滅菌15Min;剪、鑷經(jīng)160℃干烤2h。

2.3 采樣方法

2.3.1 活體樣品

固定活豬的上唇，用開口器打開口腔，用采樣搶采取扁桃體樣品，用滅菌牙簽挑至0.5ml或1.5ml離心管并作標(biāo)記，編號(hào)送實(shí)驗(yàn)室。取待檢樣品，按1:5倍體積加入DEPC水，于研缽或組織勻漿器中充分研磨，3000g離心15min，取上清液轉(zhuǎn)入離心管中編號(hào)備用。

2.3.2 內(nèi)臟樣品

采取病死豬各種臟器（淋巴結(jié)、胰臟、脾臟、回腸、肝臟和腎臟）裝入一次性塑料袋或其他滅菌容器，編號(hào)，送實(shí)驗(yàn)室。取50mg~100mg待檢樣品，按1:5倍體積加入DEPC水，于研缽或組織勻漿器中充分研磨，3000g離心15min，取上清液轉(zhuǎn)入離心管中編號(hào)備用。

2.3.3  4%EDTA抗凝血

用無(wú)菌注射器直接全血，注入含1/10 4%EDTA溶液的無(wú)菌容器中，充分混勻后編號(hào)備用。

2.3.4 排泄物

挑取少許糞便樣本于離心管中，加入適量生理鹽水，振蕩混勻，室溫3000g,離心管15min,取上清液轉(zhuǎn)入離心管中編號(hào)備用。其余液體排泄物直接轉(zhuǎn)入離心管編號(hào)備用。

2.3.5 細(xì)胞培養(yǎng)物

細(xì)胞培養(yǎng)物凍融3次，轉(zhuǎn)入離心管中編號(hào)備用。

2.3.6 存放與運(yùn)送

采集或處理的樣品在2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)24h；若需長(zhǎng)期保存，應(yīng)放置-70℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（凍融不超過(guò)3次）。采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，在6h~8h之內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。按照《獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全技術(shù)管理規(guī)范》進(jìn)行樣品的生物安全標(biāo)識(shí)。

3.實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)