循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）液體活檢是非?；钴S的研究領域，且已證明其是微創(chuàng)癌癥檢測和監(jiān)測的有力手段。在個性化疾病監(jiān)測中，細胞游離DNA（cfDNA）的表觀遺傳狀態(tài)也正成為一種有前景的生物標志物，也可能被證明在癌癥篩查中具有價值¹。納米孔測序技術能準確靈敏地檢出低豐度的cfDNA和ctDNA^2,3，且可直接從納米孔測序數(shù)據(jù)中檢測DNA甲基化，而無需在樣本制備過程中進行相關轉化或擴增。因此此技術平臺未來有望成為“液體活檢的強大工具"^4,5。

此前，意大利佛羅倫薩癌癥研究和預防機構ISPRO的Martignano團隊，創(chuàng)新地采用Oxford Nanopore納米孔低深度全基因組測序（WGS）從癌癥液體活檢樣本中檢測拷貝數(shù)畸變（CNA），并發(fā)表了相關論文³。在此基礎上，該團隊又與以色列耶路撒冷希伯來大學的Katsman團隊開展合作。最近他們證明，液體活檢中cfDNA和ctDNA的Oxford Nanopore納米孔低深度全基因組測序（WGS）技術還可用于檢測cfDNA的細胞起源、癌癥相關片段標記物和癌癥特異性甲基化特征，并且其結果與短讀長測序得到的數(shù)據(jù)集相當⁵。Katsman團隊總結了該平臺的優(yōu)點：[Oxford Nanopore Technologies]研發(fā)的測序技術操作簡單，一次測序就可獲得多種特征，測序儀成本低且便攜，因而在臨床研究領域很有價值⁵。

利用納米孔測序檢測甲基化非常吸引Katsman及其團隊，因為亞硫酸氫鹽WGS法存在樣本可能顯著降解和輸入材料損失，并可能難以確定片段規(guī)律等缺點。此外，亞硫酸氫鹽測序無法區(qū)分5mC和其他修飾，如5hmC、5fC和5CaC，而這些修飾原則上均可通過納米孔技術檢測到⁵。

Katsman團隊僅基于cfDNA分析，使用納米孔測序并與對應的短讀長WGS數(shù)據(jù)集進行比較，估計了其樣本中癌細胞的比例。為更好理解低測序深度影響，該團隊進行了降采樣實驗，并且證明了當納米孔WGS數(shù)據(jù)降采樣至0.2x平均覆蓋深度時，結果仍然一致。當以更高的深度對短讀長文庫進行測序時（中位數(shù)為1.3x），Oxford Nanopore的納米孔測序得到的腫瘤比例估計值與短讀長測序的結果極為相似。

他們還證明，Oxford Nanopore納米孔低深度全基因組測序（WGS）技術就可再現(xiàn)正常非癌細胞類型的構成，而使用短讀長亞硫酸氫鹽法（WGBS）則需要更高的測序深度才能做到。

此外，Katsman團隊發(fā)現(xiàn)，腫瘤比例更高的樣本，其片段大小也往往更短，因此，片段長度差異也可能用于區(qū)分癌癥類型⁵。采用Oxford Nanopore的測序技術，可對短片段進行高效測序，同時也可比短讀長測序法更能捕獲到較長的cfDNA片段（如Yu等人⁶最近的報告）。

Katsman團隊指出，雖然樣本規(guī)模小，但他們獲得的結果顯示，在DNA甲基化、片段化和CAN的癌癥特異性特征方面，納米孔測序數(shù)據(jù)與短讀長WGS和WGBS數(shù)據(jù)集之間大體一致。降采樣分析顯示，納米孔測序所需的基因組覆蓋度（至少0.2x），足以根據(jù)DNA甲基化特征檢測出所有樣本中癌癥衍生的DNA。

作者們還指出，他們其他相關工作表明，納米孔測序樣本制備快，測序快，可在1-3小時內就對腫瘤DNA以甲基化為基礎進行分類⁵。雖然他們沒有在自己的研究中測試過這種快速測序方法，但希伯來大學的高級研究員Ben Berman認為，這是他們研究基于納米孔技術的液體活檢的最終目標之一，即“在診療現(xiàn)場幾小時內完成全面分析"⁷。

cf DNA測序：起始樣品<1 ng，無需PCR

盡管cfDNA分析領域發(fā)展迅速，但每毫升血漿只能提取單納克或更少的cfDNA仍然構成一大瓶頸，因為測序通常需要數(shù)百納克的DNA。為解決這一難題，Lau及其同事們開發(fā)了一種無需PCR和亞硫酸氫鹽的Oxford Nanopore納米孔測序方法，以有效表征cfDNA的甲基化特征⁸。具體而言，該團隊開發(fā)了一系列操作步驟，將樣本條形碼和納米孔測序接頭有效地融入cfDNA，并系統(tǒng)地優(yōu)化反應條件，以最大限度地提高cfDNA文庫產量。

“用這種無PCR方法，只需從每份樣本提取納克量或更少的cfDNA就可生成測序文庫⁸"

用他們的方法，每份cfDNA樣本可生成多達數(shù)億讀長，比現(xiàn)有方法提高了一個數(shù)量級。例如，用5 ng DNA可獲得約600萬個已比對和過濾的讀長，用100 pg DNA可獲得約140,000個比對讀長。

他們將其方法用于表征癌癥研究樣本的cfDNA甲基化組，并證明了在治療中使用這些特征進行縱向監(jiān)測的潛力（圖1）。獲得的甲基化特征揭示了特異性治療反應和耐藥性轉移癌的出現(xiàn)。

作者們在討論他們對本研究的長期愿景時得出結論：“這種方法有可能對癌癥檢測和表征的液體活檢診斷產生影響"⁸。

圖1：結直腸癌研究樣本中cfDNA的縱向甲基化特征?？俢fDNA讀長（上圖）和與對應腫瘤匹配的甲基化特征讀長（下圖）。第400天后，具有腫瘤特異性甲基化變化的讀長片段比例顯著增加，這與腫瘤轉移進展相關。（圖來自Lau等人，2022年⁸）

“這項可行性研究表明，Oxford Nanopore低深度WGS技術可成為液體活檢的有力工具⁵"

參考文獻

1. Klein, EA. et al. Ann Oncol. 32:1167–77 (2021)

2. Marcozzi, A. et al. NPJ Genom Med. 6, 106 (2021)

3. Martignano, F. et al. Molecular Cancer. 20:32 (2021)

4. Yuen, ZW-S. et al. Nat Commun. 12:3438 (2021)

5. Katsman, E. et al. Genome Biology. 23:158 (2022)

6. Yu, SCY. et al. Proc Natl Acad Sci USA. 118. (2021)

7. Berman, B. Personal communication with Oxford Nanopore Technologies on 23 August 2022

8. Lau, BT. et al. bioRxiv. 497080 (2022)

深圳市富徹爾生物科技有限公司
地址：深圳市龍崗區(qū)橫崗街道深華街1號林展財富大廈315室，廣東省

微信公眾號