細胞膜熒光探針染料DiD,DiI,DiO和DiR是一類親脂性熒光染料家族，用于標記細胞膜等脂溶性生物結(jié)構(gòu)和疏水性組織。這是一類環(huán)境敏感型熒光染料，當它們與膜結(jié)合或者與親脂性生物分子（例如蛋白質(zhì)，雖然在水中其熒光強度很弱）結(jié)合時，其熒光強度顯著增強。它們具有很高的淬滅系數(shù)，偏光依賴性和很短的激發(fā)壽命。一旦應用于細胞中，這種染料會在細胞內(nèi)質(zhì)膜中逐步擴散，導致在其最佳濃度條件下，將整個細胞膜染色。它們不同的熒光顏色：DiI（橙色熒光）、DiO（綠色熒光）、DiD（紅色熒光）、DiR（深紅色熒光），為活細胞多色彩熒光成像分析和流式細胞術(shù)提供了一種便捷的工具。

DII(細胞膜橙紅色熒光探針)即DiIC18(3)，可以使用標準的TRITC濾光器。DiI比DiO更亮。DiI通常不會影響細胞的生存力，因此被廣泛用于正向或逆向的，活的或固定的神經(jīng)等細胞或組織的示蹤劑或長期示蹤劑(long-termtracer)。被DiI標記的神經(jīng)細胞在體外培養(yǎng)的條件下可以存活長達4周，在體內(nèi)可以長達一年。DiI在經(jīng)過固定的神經(jīng)元細胞膜上的遷移速率為0.2-0.6mm/day，在活的神經(jīng)元細胞膜上的的遷移速率為6mm/day。DiI除了簡單的細胞膜熒光標記外，還可以用于檢測細胞的融合和粘附，檢測發(fā)育或移植過程中細胞遷移，通過FRAP檢測脂在細胞膜上的擴散，檢測細胞毒性和標記脂蛋白等。

英文名稱：DiIC18(3)

                  DiI perchlorate

                 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate

中文名稱：DiI(細胞膜紅色熒光探針)

1,1'-雙十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽

CAS 號：41085-99-8

分子式：C59H97ClN2O4

分子量：933.86500

Ex/Em：550/567 nm

外 觀：紅色至暗紅色，紫色至深紫色粉末

純 度：≥95%

溶解性：溶于DMF，DMSO，甲醇

廠  家：陜西新研博美生物科技有限公司

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結(jié)構(gòu)式：

DiIC18(3) 結(jié)構(gòu)式

應用實測：

本品配成5mM溶液后為紫粉色液體溶液，澄清且無可見異物；進

行熒光染色檢測：工作條件：熒光顯微鏡，C6細胞，400×，工作濃度5μM。

結(jié)果：經(jīng)細胞膜熒光染色，在40倍物鏡下可看到清晰橙紅色熒光。

廠  家：陜西新研博美生物科技有限公司

 

操作方法

1.染色液制備

（1）配置DMSO或EtOH儲存液：儲存液用DMSO或EtOH配置濃度1～5mM?！咀ⅰ课词褂玫膬Υ嬉悍盅b儲存在-20℃，避免反復凍融。

（2）工作液制備：用合適的緩沖液（如：無血清培養(yǎng)基，HBSS或PBS）稀釋儲存液，配制濃度為1～5μM的工作液。

【注】工作液最終濃度建議根據(jù)不同細胞系和實驗體系來優(yōu)化。建議從推薦濃度的10倍范圍內(nèi)開始*濃度的摸索。

2.懸浮細胞染色

（1）加入適當體積的染色工作液重懸細胞，使其密度為1×106/mL。

（2）37℃孵育細胞2～20min，不同的細胞最佳培養(yǎng)時間不同?？梢?0min作為起始孵育時間，之后優(yōu)化體系以得到均一的標記結(jié)果。

（3）孵育結(jié)束，按1000～1500rpm離心5min。

（4）傾倒上清液，再次緩慢加入37℃預熱的生長培養(yǎng)液重懸細胞。

（5）重復（3），（4）步驟兩次以上。

3.貼壁細胞的染色

（1）將貼壁細胞培養(yǎng)于無菌蓋玻片上。

（2）從培養(yǎng)基中移走蓋玻片，吸走過量培養(yǎng)液，將蓋玻片放在潮濕的環(huán)境中。

（3）在蓋玻片的一角加入100μL的染料工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細胞。

（4）37℃孵育細胞2～20min，不同的細胞最佳培養(yǎng)時間不同。可以20min作為起始孵育時間，之后優(yōu)化體系以得到均一的標記結(jié)果。（5）吸干染料工作液，用培養(yǎng)液洗蓋玻片2～3次，每次用預溫的培養(yǎng)基覆蓋所有細胞，孵育5～10min，然后吸干培養(yǎng)基。

4.顯微鏡檢測DiD，DiO，DiI，DiR選擇合適的濾光器觀察。

5.流式細胞儀檢測經(jīng)DiD，DiO，DiI，DiR染色的細胞可分別用流式細胞儀的FL1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3或FL4通道檢測。