一文看懂顯微注射法的原理及應(yīng)用

將外源基因?qū)氚屑?xì)胞的方法有很多，其中一種比較普適、成功率又比較高的方法為顯微注射法。

首先，我們說(shuō)說(shuō)這種方法的原理：顯微注射法即是利用管尖極細(xì)（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射針，將外源基因片段直接注射到原核期胚或培養(yǎng)的細(xì)胞中，然后藉由宿主基因組序列可能發(fā)生的重組、缺失、復(fù)制或易位等現(xiàn)象而使外源基因嵌入宿主的染色體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)宿主細(xì)胞的基因改造。

一般的動(dòng)物細(xì)胞，直徑大約10微米左右；人類真核細(xì)胞直徑范圍在：3～30微米，其中人卵細(xì)胞直徑約為100微米。故直徑為0.2微米的顯微注射器針頭可以為各種類型和任意大小的動(dòng)物細(xì)胞提供精準(zhǔn)的、重復(fù)性良好的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞旁注射。在注射的過(guò)程中，動(dòng)物細(xì)胞膜也會(huì)被刺破。但因?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞膜良好的彈性和流動(dòng)性，在細(xì)胞膜被刺破以及細(xì)胞內(nèi)注入或者抽取點(diǎn)物質(zhì)之后，細(xì)胞膜還是可以恢復(fù)完整的，恢復(fù)好的細(xì)胞可以繼續(xù)存活，正常生長(zhǎng)。當(dāng)然操作手法也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的成功率，針對(duì)不同細(xì)胞的操作手法方面的研究，現(xiàn)在也有很多文章發(fā)表出來(lái)。

顯微注射技術(shù)的長(zhǎng)處為：任何DNA在原則上均可傳入任何種類的動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，對(duì)于所轉(zhuǎn)的外源基因沒(méi)有長(zhǎng)度上的限制，目前已證明數(shù)百kb的DNA片段均可以成功轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞并整合進(jìn)其染色體組。操作過(guò)程如圖所示：

接下來(lái)，我們?cè)僬f(shuō)說(shuō)顯微注射器針頭的制作：顯微注射過(guò)程中使用的微量移液管是用微電極拉制儀來(lái)制作的，先將玻璃毛細(xì)管加熱到其熔化的溫度，再將其拉制成所需的合適大小的直徑和錐形，微量移液管小頭的直徑（小至0.2微米）與纖維操縱器的高精度相關(guān)，它可以用于精準(zhǔn)的移液。

    SUTTER微電極拉制儀P-000                                                日本NARISHIGE拉制儀PC-100

顯微注射器的結(jié)構(gòu)如下圖所示：

注射器中加好需要注射的樣品之后，通過(guò)運(yùn)用顯微注射儀（壓力注射）可以獲得將微量移液管中的物質(zhì)擠噴入靶細(xì)胞中。

               日本NARISHIGE顯微注射儀IM-400    

                                       美國(guó)warner顯微注射儀PLI-100A

現(xiàn)在，我們來(lái)歸納一下顯微注射法的應(yīng)用：

（一）顯微注射法可用來(lái)做轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：顯微注射技術(shù)是利用顯微操作系統(tǒng)和顯微注射技術(shù)將外源目的基因直接注入到受精卵的原核中，使外源基因整合到受體細(xì)胞的基因組內(nèi)，再通過(guò)胚胎移植技術(shù)將整合有外源基因的受精卵移植到受體動(dòng)物的孑宮內(nèi)發(fā)育，從而獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。顯微注射法是目前轉(zhuǎn)移效率基較好的一種基因轉(zhuǎn)移方法，可直接用不含有原核載體DNA片段的外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)移；外源基因的長(zhǎng)度不受限制, 可達(dá)100kb ；實(shí)驗(yàn)周期相對(duì)比較短。它的不足之處是 ：導(dǎo)入外源基因整合位點(diǎn)和拷貝數(shù)無(wú)法控制；常導(dǎo)致插入位點(diǎn)附近宿主DNA 片段缺失、重組等突變，可造成動(dòng)物嚴(yán)重的生理缺陷。盡管如此，由于顯微注射技術(shù)直接對(duì)基因進(jìn)行操作，整合率較高，因而仍是目前建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物極為重要的方法。

（二）顯微注射法在植物、動(dòng)物的細(xì)胞發(fā)育研究的應(yīng)用：將特定的分子探針及衍生的細(xì)胞間質(zhì)成分導(dǎo)入活體細(xì)胞，為研究控制細(xì)胞功能的調(diào)控機(jī)制提供了新的視野。

（三）顯微注射法用于做克隆動(dòng)物：供體細(xì)胞的細(xì)胞核用顯微注射器移入卵母細(xì)胞后，在卵母細(xì)胞相關(guān)因子的作用下，發(fā)生了重編程回復(fù)到發(fā)育的起點(diǎn)狀態(tài)。核重編程的過(guò)程就是使在體細(xì)胞中被關(guān)閉，而在正常胚胎發(fā)育中表達(dá)的基因重新被激活的過(guò)程。

重編程有三種可能的結(jié)果：

1，供核基因組沒(méi)有進(jìn)行重編程，重構(gòu)胚很快死亡；

2，部分重編程，重構(gòu)胚在不同的發(fā)育階段死亡 ；

3，重編程，產(chǎn)生正常的克隆動(dòng)物。

（四）顯微注射器可以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞提?。涸诓桓淖兗?xì)胞生存環(huán)境的情況下，用顯微注射器對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行活細(xì)胞提取?？蓡为?dú)提取細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，或者同時(shí)提取提取細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。提取后細(xì)胞仍可存活。相比于傳統(tǒng)的裂解方式，用顯微注射器提取的樣本更為干凈，可以得到很好地電鏡圖像。

（五）顯微注射法可以實(shí)現(xiàn)更優(yōu)的CRISPR-Cas轉(zhuǎn)染方式：顯微注射器能夠進(jìn)行高速、高效地將CRISPR-Cas復(fù)合物注入細(xì)胞，幫助您克服對(duì)于傳統(tǒng)方式極難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞基因編輯問(wèn)題。

我們?cè)俳榻B一下顯微注射法的具體操作過(guò)程，顯微注射實(shí)驗(yàn)的操作需要在顯微鏡下進(jìn)行，如圖所示：

（一）在注射針內(nèi)裝液：使用無(wú)菌的微量加樣器從微注射針的后部加入待注射樣品。

（二）注射針安裝和定位：

1， 將裝液后的針頭的游離端安在連接器上，然后旋緊連接器以固定針頭，再將其固定到微操作儀的托針管上。

2， 把載有待注射樣本的培養(yǎng)皿放在顯微鏡載物臺(tái)上，用低倍物鏡對(duì)準(zhǔn)細(xì)胞調(diào)焦；

3， 移動(dòng)針頭并在顯微鏡下調(diào)整微操作儀，直到針頭的陰影在視野的中心上方；

4， 使用工作用放大倍數(shù)，調(diào)準(zhǔn)細(xì)胞焦距，找到針尖。

（三）顯微注射：

1，使針尖對(duì)準(zhǔn)細(xì)胞的待注射部位（細(xì)胞與針尖在同一焦面上），旋轉(zhuǎn)推進(jìn)旋鈕，針刺入細(xì)胞內(nèi)（卵膜、細(xì)胞膜、核膜）。

2， 旋轉(zhuǎn)加樣旋鈕，將樣本加入，并離開(kāi)細(xì)胞。

余下，就是將操作好的細(xì)胞放回好好培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

顯微注射法的缺點(diǎn)是：實(shí)驗(yàn)所需的設(shè)備精密而昂貴、操作技術(shù)需要長(zhǎng)時(shí)間的練習(xí)，以及每次只能注射有限的細(xì)胞。