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單克隆篩選的加藥時間和維持濃度
閱讀：1297 發(fā)布時間：2019-7-18
單克隆篩選的加藥時間和維持濃度
由于基因轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)之后要一段時間才能表達出蛋白質(zhì)，所以單克隆篩選不能太早；但是也不能太晚，因為轉(zhuǎn)染了外源基因的細胞代謝負荷較大，增值較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細胞所淹沒，終導致單克隆篩選不出陽性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染24小時之后才開始篩選。
隨著細胞的代謝的濃度和活性都回下降，所以每3~5天都要更換一次篩選液，這時藥物濃度可以降至200ug/ml。加抗生素的時機，主要是考慮插入到細胞基因組的抗性基因是否已經(jīng)得到表達，一般是轉(zhuǎn)染48小時后加入抗生素，挑出單克隆后就可以用維持濃度，一般是篩選濃度的1/2。
關(guān)于維持濃度，有人說細胞會出現(xiàn)對抗生素的抗性，應(yīng)不斷提高其濃度。而且，如果你要挑選到幾個陽性克隆中較高表達的克隆的話，可以調(diào)整抗生素的濃度。當然，抗性基因高表達，目的基因不一定就跟著高表達。
單克隆篩選時的培養(yǎng)液。單克隆篩選約6天左右，細胞會大量死亡，孔中只剩下的細胞。這時會出現(xiàn)兩個問題：1.死亡的細胞會裂解釋放出有害物質(zhì)，導致表達的陽性細胞死亡，即非選擇性死亡，因此要及時換液；2.孔中細胞數(shù)目很少，細胞之間的信號會變得很弱，也會導致陽性細胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。
單克隆篩選時出現(xiàn)的問題及其解決辦法：
做細胞的篩選，現(xiàn)在已經(jīng)篩選3周，在6孔板中已經(jīng)長出一些細胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2ul胰酶消化，在消化過程中，胰酶擴散，細胞已經(jīng)四散開，和周圍的其它細胞簇融合在一起（我的細胞 簇離的很近），就是說幾個細胞簇被胰酶融合在一起，那樣根本沒有辦法做下去了，該怎么辦？
a、可以減少胰酶量；胰酶在加入之前要用37度溫箱預(yù)熱，并且PBS潤洗細胞層，以減少可能殘存的血清的影響；
b、加入胰酶后，稍過幾秒鐘就可以吸走消化液了，不用吸干凈，然后放到37度溫箱中繼續(xù)作用1MIN，這時，消化酶可以繼續(xù)作用的，又可避免胰酶擴散；
c、顯微鏡下觀察細胞*松散開，就可以在你感興趣的局部加培養(yǎng)基，并吸走你的可隆了呀
d、具體消化的時間，你注意摸索一下，如果在步驟2中顯微鏡下見細胞尚未*松散開，可以再重復的，直到松散開，能夠被吸走為止。