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在使用單細(xì)胞鋪板可能會(huì)出現(xiàn)的問(wèn)題

閱讀:874        發(fā)布時(shí)間:2019-10-23
   單細(xì)胞鋪板是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)又必須掌握的一門技術(shù),看似簡(jiǎn)單,我們卻經(jīng)常遇到:如細(xì)胞居中或者中間稀疏等不均勻分布的現(xiàn)象,導(dǎo)致我們只能扔掉,重新鋪板。既耽擱時(shí)間又浪費(fèi)了細(xì)胞及培養(yǎng)板等資源。歷經(jīng)多次失敗后,才發(fā)現(xiàn)原來(lái)單細(xì)胞鋪板是有規(guī)律可循的,今天我們就聊一聊:細(xì)胞鋪板的技巧。

  首先,了解一下單細(xì)胞鋪板的必要性!

  從經(jīng)濟(jì)和的角度來(lái)說(shuō),需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同規(guī)格的培養(yǎng)板。如在進(jìn)行藥物對(duì)待測(cè)細(xì)胞半抑制率(IC50)測(cè)試時(shí),通常使用96孔板,一方面可以設(shè)置濃度梯度;另外還可一次性測(cè)多個(gè)藥物,減少實(shí)驗(yàn)誤差。

  下面我們?cè)賮?lái)了解一下單細(xì)胞鋪板可能會(huì)出現(xiàn)的問(wèn)題

  1、細(xì)胞計(jì)數(shù)前后出現(xiàn)較大誤差?

  考慮細(xì)胞沉降導(dǎo)致懸液不勻;懸液體積過(guò)大或過(guò)小;稀釋倍數(shù)太高或太低等原因造成。

  2、如何克服細(xì)胞懸液不均勻的問(wèn)題?

  盡量將細(xì)胞吹打?yàn)閱蝹€(gè),防止抱團(tuán),且用移液槍充分吹打,使其均勻懸浮在培養(yǎng)基中。

  3、一般加多少細(xì)胞懸液合適?

  由于加入計(jì)數(shù)室的量,過(guò)少會(huì)導(dǎo)致計(jì)數(shù)室內(nèi)出現(xiàn)氣泡,過(guò)多則會(huì)使得計(jì)數(shù)板上的蓋玻片不緊貼計(jì)數(shù)板,使得高度變高,體積變大;計(jì)數(shù)室體積為9mm3,所以一般加15ul左右。

  4、計(jì)數(shù)時(shí),細(xì)胞稀釋倍數(shù)如何控制?

  若是計(jì)數(shù)室細(xì)胞過(guò)稀或過(guò)密,會(huì)造成較大誤差,一般適濃度為5~10×105細(xì)胞/ml。如一般10cm皿的細(xì)胞約300-500萬(wàn)個(gè),一些細(xì)胞個(gè)體小也能達(dá)到1000-2000萬(wàn),可根據(jù)所需細(xì)胞數(shù)目取出部分作稀釋或連續(xù)稀釋后計(jì)數(shù)。舉例來(lái)說(shuō)可將100ul細(xì)胞懸液加入到900ul培養(yǎng)基中,混勻后進(jìn)行計(jì)數(shù),計(jì)數(shù)所得乘以10即為實(shí)際細(xì)胞密度。

  5、計(jì)數(shù)的原則有哪些?

  計(jì)數(shù)時(shí)對(duì)壓在外圈邊線的細(xì)胞遵循“計(jì)上不計(jì)下,計(jì)左不計(jì)右”的統(tǒng)計(jì)學(xué)原則,遇到兩個(gè)以上的細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)計(jì)為一個(gè)細(xì)胞。

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