單細(xì)胞分離廣泛應(yīng)用于眾多研究領(lǐng)域
閱讀:753 發(fā)布時(shí)間:2021-11-29
單細(xì)胞分離對于很多應(yīng)用場景如,單細(xì)胞測序,單克隆培養(yǎng)等而言是關(guān)鍵的前處理步驟,殊不知單細(xì)胞分離的前處理步驟也有很多需要注意的地方。下面我們就來了解一下,為了提高單細(xì)胞分離的效率和效果,都有哪些小竅門。
單細(xì)胞分離用于區(qū)分碎片、死細(xì)胞和活細(xì)胞,然后可以根據(jù)操作流程分離單個(gè)活細(xì)胞,為了去除細(xì)胞結(jié)團(tuán),在染色之后可以用40um左右的細(xì)胞篩網(wǎng)過濾細(xì)胞,盡量保證在上樣的時(shí)候樣本都是單個(gè)細(xì)胞。
作為對照,我們采用細(xì)胞密度進(jìn)行手動(dòng)有限稀釋法鋪板。然后,用顯微鏡在明場下觀察每個(gè)孔的細(xì)胞(或者微球)的數(shù)量,同樣的實(shí)驗(yàn)持續(xù)7天,每天做一組對比實(shí)驗(yàn),取平均值,通過統(tǒng)計(jì)孔板中單細(xì)胞、兩個(gè)細(xì)胞和空孔的數(shù)量來衡量儀器的分選效率,可通過差速離心或密度梯度離心和過濾的方法,根據(jù)大小、形狀和密度對細(xì)胞進(jìn)行人工分離。
例如,通過各種密度梯度離心,可以從外周血或骨髓中分離出單核細(xì)胞,使用熒光染料可以從死細(xì)胞或凋亡細(xì)胞中標(biāo)記和分離活細(xì)胞,富集細(xì)胞亞群或稀有細(xì)胞類型時(shí),可將標(biāo)記抗體基于磁珠的分離方法相結(jié)合進(jìn)行陽性/陰性篩選。多種因素將影響方法的選擇,包括樣本類型、可用抗體種類和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
它可以快速識別可能會(huì)使下游步驟變得復(fù)雜的碎片、細(xì)胞雙聯(lián)體和細(xì)胞聚集物,更重要的是,準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)對于實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分離過程的目標(biāo)細(xì)胞通量至關(guān)重要,可以使用顯微鏡和血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行手動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù),也可以使用自動(dòng)化系統(tǒng)進(jìn)行準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù),采集細(xì)胞懸液的明場圖像,根據(jù)細(xì)胞特征(例如大小、亮度和圓度)生成直方圖進(jìn)行更詳細(xì)的檢查。
在以上步驟完結(jié)之后,我們就能得到一個(gè)好的單細(xì)胞懸液了。最后我們用Namocell單細(xì)胞分離儀完成后面的單細(xì)胞分離工作,最快可以在1min以內(nèi)完成96孔板的鋪板,6min以內(nèi)完成384孔板的鋪板,并且整版單細(xì)胞效率高達(dá)90%左右。