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近些年，生物制藥迅猛發(fā)展，法規(guī)要求“源于細胞培養(yǎng)的產(chǎn)品都必須確保無支原體污染"，制藥企業(yè)對支原體檢測越來越重視。
在快速檢測方法出現(xiàn)以前，傳統(tǒng)檢測方法時效性不足，因此只能“抓頭"和“顧尾"，但行業(yè)內(nèi)在注重支原體檢測方法性的同時，對時效性的要求越來越高。如第四期所述：傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和DNA染色法雖然有著自身的優(yōu)點，但較長的檢測周期或靈敏度逐漸不能滿足行業(yè)快速發(fā)展的需求。
NAT方法從當前支原體快速檢測方法中脫穎而出，已經(jīng)被美國藥典[1]、歐洲藥典[2]和日本藥典[3]收錄，并明確提到NAT方法在經(jīng)過適當驗證后，可用于檢測方法補充或替代藥典方法進行放行檢測。國內(nèi)的相關(guān)機構(gòu)和也在這方面做了的研究工作。
此外，任何一種檢測方法的驗證都需要建立在方法適用性和方法優(yōu)化的基礎(chǔ)之上。支原體檢測方法在IND階段和臨床階段沒有要求必須做到完整的驗證，但是BLA前必須做面驗證[9]。
需要強調(diào)一點，不管是歐洲藥典還是日本藥典，對NAT方法驗證都有提到：標準品可以是支原體菌株也可以是支原體核酸。
支原體核酸能夠被檢出。這一方面數(shù)據(jù)可由廠家提供證明也可以根據(jù)實際情況進行選材驗證；
非支原體DNA不會被檢出。一般選用系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系比較近的革蘭氏陽性細菌來驗證，包括Clostridium（梭菌屬）, Lactoacillus（乳酸菌屬）和Streptococcus（鏈球菌屬）的細菌。但是在實際操作中，也會引入宿主細胞和實驗室常使用的表達菌株DNA進行專屬性驗證，以確認細胞基質(zhì)不會干擾結(jié)果判定。此外，由于支原體檢測實驗和操作環(huán)境都有的人源DNA氣溶膠存在，因此，也建議引入人源DNA進行專屬性確認，來排除檢測結(jié)果假陽性。
檢測限
檢測限指能夠檢測到的樣品中的The Lowest目標支原體或核酸濃度，在設(shè)定濃度情況下進行陰性/陽性確認即可，不要求定量。從統(tǒng)計學(xué)角度要求95%檢測孔中能夠檢測為陽性的The Lowest支原體或拷貝數(shù)濃度即檢測限。
藥典NAT方法驗證中但是不限于使用如下支原體進行方法學(xué)驗證，包含了制藥領(lǐng)域原輔料、操作人員等潛在污染源的代表性支原體類型。
實際驗證中，一般建議選取自己工藝中可能引入的支原體類型進行驗證即可
如工藝中涉及血清使用，建議驗證精氨酸支原體和發(fā)酵支原體；
如果涉及貼壁細胞培養(yǎng)和胰酶使用，建議驗證豬鼻支原體；
如果涉及植物源原輔料，建議進行柑橘頑固病螺原體驗證；
生產(chǎn)工藝中人一直會參與實驗操作，因此口腔支原體、肺炎支原體和唾液支原體都建議做驗證。
對于每種支原體，需要在不同天，至少各做3個稀釋梯度的標準品，每個稀釋梯度做8個重復(fù)檢測或不同天各做 4個稀釋梯度，每個稀釋梯度做6次重復(fù)檢測，每個梯度的復(fù)孔數(shù)不低于24孔，以便統(tǒng)計學(xué)分析，并以95%陽性率結(jié)果進行檢測限確定。也可以進行前期摸索，確定一個大致陽性閾值點，然后在此濃度范圍附近進行檢測限確認，進而減少工作量。
耐用性
耐用性指當檢測方法參數(shù)有小的刻意變化時，檢驗結(jié)果不受影響的能力，為方法正常使用時的可靠性提供依據(jù)。耐用性的評估在方法開發(fā)階段就應(yīng)該被考慮，比如試劑中Mg2+、引物和dNTP的濃度，核酸提取步驟的變動以及不同核酸擴增儀也是經(jīng)常用來評估的對象。與此同時，也建議耐用性考察盡量包括樣品保存方式，以及不同人員操作數(shù)據(jù)，來盡可能的減少檢測偏差。
以上為支原體檢測方法的驗證內(nèi)容。要替代藥典方法，還需要做靈敏度可比性研究，證明NAT方法的靈敏度不低于藥典現(xiàn)有方法，即不低于10 CFU/mL或100CFU/mL的靈敏度。有兩種方案可以用于可比性研究：
核酸檢測與藥典方法平行進行，檢測并分析支原體LOD濃度情況下的檢出率；
將NAT方法的數(shù)據(jù)與此前藥典方法驗證的靈敏度數(shù)據(jù)對比。此種情況下，所用標準品的標定及穩(wěn)定性都需要有明確的文件支持。
支原體NAT方法作為定性檢測，其驗證內(nèi)容相對定量檢測方法驗證來說較為簡單。但是從實質(zhì)上看，驗證復(fù)雜程度更大，而且考慮到標準品的來源、標定、保存及稀釋檢測，本身就是一項復(fù)雜工作。
但是就像前面內(nèi)容所提到，支原體NAT方法本來就不能追求一次性完成，在BLA前完成完整驗證即可。而且，支原體檢測的本質(zhì)是盡早盡可能靈敏的發(fā)現(xiàn)污染，這種檢測不是通過一次性驗證能夠完成的，這是一項持續(xù)的過程，直到工藝步驟全部鎖定。
目前為止，已經(jīng)有很多企業(yè)使用MycoSEQ完成了NAT的方法驗證工作，并已經(jīng)用于產(chǎn)品的放行檢測。因此為MycoSEQ的使用積累了寶貴的經(jīng)驗和實踐基礎(chǔ)。
