如何快速構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株？

如何在實(shí)驗(yàn)流程上篩出高效表達(dá)的單克隆，

縮短篩選周期？

又將如何評(píng)估單克隆的穩(wěn)定性？

以 Gibco ExpiCHO 培養(yǎng)基系統(tǒng)篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株為例，小編為大家簡(jiǎn)述單克隆的篩選流程：

Gibco 培養(yǎng)基、補(bǔ)料、添加劑等，可用于常規(guī)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)

1.準(zhǔn)備載體

通過內(nèi)切酶進(jìn)行載體線性化處理，利用核酸提取系統(tǒng)和純化試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒DNA提純。

賽默飛 KingFisher Flex 基于磁珠分離的高通量核酸提取設(shè)備

2.轉(zhuǎn)染細(xì)胞

轉(zhuǎn)染前利用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀確保細(xì)胞密度控制在2*106-6*106cells/mL，細(xì)胞活力在95–99%之間。

將ExpiFectamine CHO轉(zhuǎn)染系統(tǒng)與質(zhì)粒DNA室溫孵育1-5min后轉(zhuǎn)移到搖瓶培養(yǎng)系統(tǒng)。37℃ 8% CO2孵育兩天后測(cè)定細(xì)胞活力，細(xì)胞個(gè)數(shù)以及抗體滴度 (理想情況高于4 mg/L)。

Nalgene一次性PETG無菌搖瓶

3.篩選

以5*105cells/mL的細(xì)胞密度，在30 mL ExpiCHO表達(dá)培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。搖瓶中加入G418或Puromycin等相應(yīng)選擇壓力。培養(yǎng)第7天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每3-5天傳代一次。細(xì)胞密度達(dá)到1*106 viable cells/mL，細(xì)胞活力超過85%時(shí)，階段一結(jié)束，并進(jìn)行細(xì)胞凍存。從階段一獲取的細(xì)胞，將選擇壓力調(diào)整為階段一的2-5倍進(jìn)行再次篩選。

4.混合細(xì)胞株生產(chǎn)力的評(píng)估

從階段二獲取的細(xì)胞，以5*105cells/mL的細(xì)胞密度，在125mL搖瓶中培養(yǎng)。分別在第0，3，5，7，10，12和14天 (建議把第零天放到周五) 取樣檢測(cè)細(xì)胞密度，活力和抗體滴度。

5.獲取單克隆

將混合細(xì)胞株按照如下稀釋比例稀釋至1000 cells/mL，利用分液器以0.5 cell/孔的密度接種至96孔板中，靜置培養(yǎng)。

混合細(xì)胞株的層級(jí)稀釋比例

賽默飛Combi nL自動(dòng)分液器

分液體積50納升至50微升

6.單克隆的放大培養(yǎng)以及篩選評(píng)估

將篩選出的單克隆從96孔板依次放大至125 mL搖瓶中培養(yǎng)。并進(jìn)行層級(jí)篩選。

初始篩選：6孔板培養(yǎng)5天后，評(píng)估細(xì)胞蛋白表達(dá)，從中選取表達(dá)量較高的15-40個(gè)克隆轉(zhuǎn)移至125 mL 搖瓶中；并進(jìn)行細(xì)胞液氮凍存。

二級(jí)篩選：14天簡(jiǎn)單補(bǔ)料添加評(píng)估，分別在0，3，5，7，10，12和14天取樣檢測(cè)細(xì)胞密度，活力和抗體滴度；并在第3，5，7天補(bǔ)加葡萄糖培養(yǎng)。并進(jìn)行細(xì)胞液氮凍存。

三級(jí)篩選：14天補(bǔ)料添加評(píng)估，細(xì)胞復(fù)蘇傳代2-5次后，3-14天檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)密度、活力以及蛋白表達(dá)。每個(gè)克隆均需要有1-3個(gè)平行對(duì)照。

PerkinElmer LabChip GXII Touch 自動(dòng)化微流控電泳系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)抗體滴

度純度和糖譜分析，單樣品分析耗時(shí)可小于40s

7.細(xì)胞株穩(wěn)定性的評(píng)估

接下來需要評(píng)估獲取的單克隆可以在多長(zhǎng)的周期穩(wěn)定表達(dá)蛋白。挑選16個(gè)單克隆，在搖瓶中傳代60次或者連續(xù)培養(yǎng)12周評(píng)估單克隆的穩(wěn)定性。