截至目前，超過(guò)5種CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品獲得美國(guó)FDA認(rèn)證，批準(zhǔn)。國(guó)內(nèi)CAR-T產(chǎn)品也已獲批。但CAR-T產(chǎn)品也存在著生產(chǎn)周期長(zhǎng)、有細(xì)胞因子風(fēng)暴及神經(jīng)毒性副作用等挑戰(zhàn)。

CAR-NK細(xì)胞被認(rèn)為可能應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，其發(fā)展引起了研究人員的極大興趣——主要是因?yàn)橄啾葌鹘y(tǒng)的CAR-T細(xì)胞，CAR-NK細(xì)胞具有*的優(yōu)勢(shì)。與CAR-T細(xì)胞不同，CAR-NK細(xì)胞可以應(yīng)用于異體細(xì)胞治療環(huán)境，這意味著它有潛力成為一種“現(xiàn)成的"治療方法，并降低移植物抗宿主病(GVHD)的風(fēng)險(xiǎn)，解決了周期長(zhǎng)，必須應(yīng)對(duì)個(gè)體化需求的問(wèn)題。CAR-NK細(xì)胞不像CAR-T細(xì)胞那樣在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間存活，從而降低了靶向正常細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)。此外，由于NK細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子相與T細(xì)胞不同，NK細(xì)胞造成細(xì)胞因子釋放綜合征(CRS)和神經(jīng)毒性的風(fēng)險(xiǎn)較低。

更重要的是，CAR在NK細(xì)胞中的表達(dá)可以增加其固有的細(xì)胞殺傷能力，改善未修飾前NK細(xì)胞的治療結(jié)果。已知未修飾的NK細(xì)胞臨床前研究已經(jīng)產(chǎn)生了很好的結(jié)果及安全性，但仍未轉(zhuǎn)化為成功的臨床實(shí)驗(yàn)，雖有多達(dá)50%的患者中產(chǎn)生了陽(yáng)性反應(yīng)，但其他實(shí)驗(yàn)報(bào)告的臨床療效還是有限。提示我們CAR修飾的NK細(xì)胞治療可能是更好的治療方案。

慢病毒NK細(xì)胞轉(zhuǎn)染方案

限制CAR-NK細(xì)胞治療發(fā)展的挑戰(zhàn)之一是基因轉(zhuǎn)染方式。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已被廣泛研究，轉(zhuǎn)染后在NK細(xì)胞中的效率約為27%-52%。以及轉(zhuǎn)染后CAR-NK細(xì)胞活力低和突變的風(fēng)險(xiǎn)而受到限制。一種更安全的選擇是用慢病毒(LV)轉(zhuǎn)染，因?yàn)樗峁┝私档突蚨拘院筒迦胪蛔兊娘L(fēng)險(xiǎn)。然而，其轉(zhuǎn)染效率往往比逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)錄效率要低得多。

CAR-NK細(xì)胞有幾種類型的慢病毒(LV)正在開(kāi)發(fā)中，近人們對(duì)優(yōu)化vesicular stomatitis virus-G (VSV-G)-pseudo typed LV(VSV-G LVs)的轉(zhuǎn)染很感興趣。

 

St. Jude兒童研究醫(yī)院的研究人員于2021年6月在Cytotherapy雜志發(fā)表文章，研究表明，VSV-GLVs轉(zhuǎn)染的NK細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低和細(xì)胞活力低是由于toll樣受體4(TLR4)通路的激活。

VSV-G激活TLR4信號(hào)通路

免疫系統(tǒng)使用模式識(shí)別受體，如toll樣受體，來(lái)識(shí)別細(xì)菌和病毒的病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)。TLR4以其能夠識(shí)別革蘭氏陰性菌外膜上的脂多糖(LPS)而聞名，也能識(shí)別病毒。

NK細(xì)胞在細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)均表達(dá)TLR4，使得NK細(xì)胞對(duì)VSV-GLV激活TLR4通路特別敏感。VSV-G激活胞內(nèi)TLR4信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)信號(hào)級(jí)聯(lián)，終導(dǎo)致I型干擾素的產(chǎn)生?；谝酝难芯浚覀冋J(rèn)為VSV-GLV的轉(zhuǎn)染效率較差，可能是由于TLR4通路的激活所致。因此，Chockley等人研究了使用藥物MRT67307抑制TLR4通路的下游信號(hào)分子TBK1和IKKε。

單細(xì)胞功能蛋白質(zhì)組技術(shù)評(píng)價(jià)基因編輯的NK細(xì)胞

研究表明，在轉(zhuǎn)染方案中使用MRT67307，顯著提高了NK細(xì)胞中HER2-CAR的轉(zhuǎn)染效率，高達(dá)18%-53%的細(xì)胞表達(dá)CAR（圖1），平均數(shù)為34%。

圖1：CAR表達(dá)百分比

此外，作者在針對(duì)HER2+A549細(xì)胞系的4小時(shí)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中評(píng)估了CAR的功能，HER2-CAR NK細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)腫瘤細(xì)胞的顯著殺傷。在MRT67307的存在下，轉(zhuǎn)染的HER2-CAR-NK細(xì)胞的腫瘤殺傷力顯著提高（圖2）。

圖2：共培養(yǎng)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

研究者使用IsoPlexis的單細(xì)胞分泌組解決方案評(píng)估HER2 CAR-NK細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌譜。與未修飾的NK細(xì)胞相比，兩種細(xì)胞的多功能性（分泌兩種及兩種以上因子的能力）存在顯著差異，主要表現(xiàn)在未經(jīng)修飾的NK細(xì)胞平均分泌2-3個(gè)效應(yīng)分子，其中不到13%的細(xì)胞分泌顆粒酶B，少于3.5%的細(xì)胞分泌其他細(xì)胞因子，多功能細(xì)胞占整個(gè)細(xì)胞的比例小于20%；而HER2 CAR-NK細(xì)胞中的部分亞群則能夠產(chǎn)生多達(dá)10種效應(yīng)分子，細(xì)胞分泌一系列的效應(yīng)細(xì)胞因子，包括：顆粒酶B、穿孔素、TNF-α、MIP1-β、MCP-1、RANTES和IL-8，其多功能細(xì)胞占比超過(guò)50%（圖3）。

圖3：NK細(xì)胞多功能性，細(xì)胞因子譜，多功能指數(shù)的差異。

本研究的數(shù)據(jù)表明，抑制TBK1和IKKε顯著改善了NK細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)，并產(chǎn)生了功能完整的細(xì)胞產(chǎn)物，與未修飾的NK細(xì)胞和沒(méi)有MRT67307轉(zhuǎn)導(dǎo)的NK細(xì)胞相比，CAR-NK細(xì)胞表現(xiàn)出更的細(xì)胞毒性能力。

利用IsoPlexis的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)，作者能夠表征使用VSV-Glv轉(zhuǎn)基因NK細(xì)胞的可靠性。該研究的NK細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)方法有可能適用于異源基因CAR-NK細(xì)胞治療的臨床生產(chǎn)，這在現(xiàn)成的細(xì)胞治療研究領(lǐng)域具有重大的意義。

IsoLight全自動(dòng)單細(xì)胞功能蛋白質(zhì)組學(xué)分析系統(tǒng)

高度集成的系統(tǒng)，包含液體處理器、清洗站、顯微鏡、細(xì)胞培養(yǎng)裝置、微陣列掃描儀的分析系統(tǒng)，單次24小時(shí)內(nèi)自動(dòng)化完成8個(gè)芯片的檢測(cè)。

IsoCode微流控單細(xì)胞分泌蛋白組芯片

每張芯片里含有12,000個(gè)獨(dú)立的亞納升級(jí)別的微室，結(jié)合微流控技術(shù)，可以捕獲500-1,500個(gè)單細(xì)胞。此外，*的抗體編碼技術(shù)可實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞水平上多達(dá)32種因子的檢測(cè)。

IsoSpeak多維生信分析軟件

自動(dòng)化生物信息分析軟件，按鈕式界面設(shè)計(jì)，直觀易使用，結(jié)果可視化，綜合性的定量指標(biāo)——多功能強(qiáng)度指數(shù)(PSI)，可揭示復(fù)雜的單個(gè)細(xì)胞多個(gè)因子應(yīng)答的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)。