IsoPlexis的單細胞蛋白組技術(shù)不僅可以“向外看"---檢測培養(yǎng)單個細胞胞外分泌的細胞因子；也可以“向內(nèi)看"---檢測單細胞水平胞內(nèi)蛋白。使用細胞內(nèi)蛋白組學相關(guān)panel可以在幾天內(nèi)揭示腫瘤靶向治療中信號通路變化。

在腫瘤治療耐藥性研究中，研究人員經(jīng)常通過基因組研究來了解腫瘤的微環(huán)境和信號通路，但腫瘤中一些功能的適應性變化沒有引起基因?qū)用娴母淖?，所以僅憑基因組學研究很難提供腫瘤治療耐藥性機制的完整信息。單細胞胞內(nèi)蛋白組解決方案是研究腫瘤信號通路和治療耐藥性基礎的關(guān)鍵工具，幫助研究人員進行完整的功能表征。

檢測胞內(nèi)蛋白的區(qū)別

傳統(tǒng)檢測細胞內(nèi)磷酸化蛋白方法之一是流式細胞術(shù)，進行表面抗體標記分型細胞再進行細胞固定破膜，讓熒光抗體進入細胞內(nèi)標記胞內(nèi)磷酸化蛋白。這聽起來不難，但實際有好幾個需要考慮的實驗步驟。

首先，固定破膜液的選擇會影響抗體標記的效果，還要兼顧表面標記不受胞內(nèi)熒光抗體的影響。其次是抗體的挑選跟配色方案，不是所有經(jīng)過驗證的抗體都可以不受固定破膜液的影響，標記到胞內(nèi)磷酸化蛋白；抗體上帶的熒光染料也有可能被固定液破壞導致信號不足。如果一次想看好幾個胞內(nèi)磷酸化蛋白，還要考慮抗體之間的特異性不跟其它蛋白交叉反應，以及熒光染料之間的熒光補償問題。倘若還要考慮表面蛋白標記分型的抗體，整個流式抗體配色方案就要思考設計一整天，更不用說實驗后還得根據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果優(yōu)化整個方案了，幾次實驗下來花費的時間可能就是幾周了。總結(jié)以上幾點，一般流式檢測胞內(nèi)磷酸化蛋白靶標只能是2-5種。

IsoPlexis單細胞胞內(nèi)磷酸化蛋白質(zhì)組解決方案針對每個芯片中500-1500個單個細胞，分析每個細胞多達15種磷酸化蛋白。經(jīng)過反復驗證的抗體組合，通過這些信號通路中關(guān)鍵磷酸化蛋白的表征研究細胞信號通路，研究整個信號網(wǎng)絡的變化，并揭示關(guān)鍵的適應性耐藥途徑。IsoPlexis系統(tǒng)還是全自動化運行的，單細胞懸液樣本加入微流控芯片后，細胞在芯片中進入單細胞微室、裂解單細胞，微室為磷酸化蛋白檢測提供了一個更大的捕獲區(qū)域（圖1），單細胞的分離、裂解，以及細胞內(nèi)蛋白的檢測都由儀器自行完成。
 

圖1：以流式為基礎的傳統(tǒng)方法與單細胞胞內(nèi)蛋白組技術(shù)對比
 

需要特別指出的是流式配色panel設計是一個非常復雜的過程。使用IsoPlexis單細胞檢測系統(tǒng)避免了復雜流式配色panel的設計，系統(tǒng)使用條形碼抗體，避免了檢測過程中不同蛋白之間的相互干擾。IsoPlexis進行了相關(guān)的方法開發(fā)，配套的芯片panel已被驗證和優(yōu)化，適用于不同的應用方向（圖2），不需要研究人員進行優(yōu)化，可立即使用 。這意味著研究人員不需要耗費可能長達數(shù)個月的時間去建立方法，開發(fā)panel，再進行實驗；只需要幾天內(nèi)就可以得到結(jié)果。

圖2：經(jīng)過驗證的panel

應用案例之一：在腫瘤靶向治療的過程中，一旦對治療產(chǎn)生耐藥性，腫瘤就會復發(fā)，必須開發(fā)更好的治療方案。治療耐藥性的表征對于創(chuàng)建有效治療方案至關(guān)重要；因為腫瘤細胞存在異質(zhì)性，定義和測量每個腫瘤細胞對信號通路的貢獻至關(guān)重要。通過同時對不同信號通路中關(guān)鍵節(jié)點的多達15個磷酸化蛋白進行檢測，可以幫助分析多重蛋白之間關(guān)聯(lián)性，評估信號通路是否被抑制，或者新的信號通路是否建立，進一步得到完整的信號通路網(wǎng)絡信息，評估治療方案的耐藥性，以確定有效的靶點（圖3）。

另一篇應用在Cancer Cell的一篇文章中：利用IsoPlexis的單細胞胞內(nèi)蛋白組技術(shù)，研究人員能夠通過分析信號通路中不同磷酸化蛋白的協(xié)同關(guān)系評估膠質(zhì)細胞瘤治療耐藥性的產(chǎn)生。研究表明，耐藥性可以通過一種非遺傳（適應性）機制進行，該機制在單一抑制劑用藥后的幾天內(nèi)被激活（圖3）。
 

圖3：用藥后，胞內(nèi)信號通路的改變

單一藥物治療后，測量到腫瘤胞內(nèi)功能的適應性變化提示研究者進行聯(lián)合治療，即同時使用多種靶向藥物進行治療，應對單一藥物治療帶來的耐藥性問題。結(jié)果顯示多藥聯(lián)用可以有效阻止腫瘤生長（圖4）。這種單細胞分析方法為設計更有效的腫瘤聯(lián)合治療策略提供了可能。
 

圖4：多種藥物聯(lián)用，評估有效治療方案

IsoPlexis單細胞蛋白質(zhì)組檢測技術(shù)相比傳統(tǒng)方法省去了流式實驗方案設計，全自動儀器節(jié)省了實驗人力物力，更重要的是節(jié)省寶貴的樣本，使用單細胞胞內(nèi)磷酸化蛋白質(zhì)組芯片針對15種磷酸化蛋白捕獲相對完整的信號通路網(wǎng)絡信息。另外還有單細胞分泌蛋白質(zhì)組及多重細胞因子蛋白質(zhì)組芯片，3款芯片聯(lián)用可以更地了解免疫細胞對不同治療方案的功能性反應。
 

文章來源：IsoPlexis