單細胞分泌（功能）蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)揭示了同時分泌多種細胞因子的少數(shù)高度多功能細胞亞群（subsets of highly-polyfunctional cells），這些超級細胞可以預(yù)測患者在體內(nèi)的反應(yīng)和疾病進展，負責協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)和加速先進治療藥物的開發(fā)。

目前最被關(guān)注的腫瘤免疫治療方法包括以PD-1/PD-L1抗體為代表的免疫檢查點抑制劑療法、以CAR-T為代表的細胞免疫療法、腫瘤疫苗以及小分子抑制劑等新興免疫療法。近年來，大量以免疫單藥及聯(lián)合治療的臨床研究在國內(nèi)外陸續(xù)開展，取得了多項令人振奮的結(jié)果，腫瘤免疫治療生物標記物在治療和預(yù)后預(yù)測中也展現(xiàn)出相當?shù)臐摿?/span>。然而，免疫療法的作用機制比我們想象的更為復(fù)雜，受益群體相對有限，大多情況下只有少部分癌癥患者能夠從中獲益，PD-L1表達、腫瘤突變負荷（TMB）、高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-H）等生物標志物無法滿足臨床需求，亟需探索更好的生物標志物
 

單細胞分泌蛋白組學(xué)興起

免疫細胞在抗腫瘤、抗感染等免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，細胞因子就像免疫細胞的工具，可以幫助免疫細胞有效對抗“敵人"，抵御和清除腫瘤及自身損傷細胞。不同細胞因子表現(xiàn)出廣泛的多效性，以協(xié)調(diào)先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，通過分析免疫細胞產(chǎn)生的細胞因子，可以幫助分析和評估細胞的免疫功能。有些免疫細胞不僅分泌一種細胞因子，可能分泌兩種、三種、四種或以上，可分泌兩種及以上細胞因子的細胞稱為“多功能細胞"（polyfunctional cells或multifunctional cells），在過去的十多年有很多研究發(fā)現(xiàn)，這群細胞比只分泌一種細胞因子的細胞（單功能細胞）的功能更強，在體內(nèi)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答更有效更持久。

傳統(tǒng)的細胞因子檢測技術(shù)，如ELISA、流式微球分析（CBA，Cytometric Bead Array）、芯片多因子檢測等都是檢測血清或細胞培養(yǎng)上清中群體細胞的平均蛋白信號，不能區(qū)分這些因子是由哪些細胞分泌的，也無法分辨單細胞分泌多種因子的多能性及共分泌的協(xié)同效應(yīng)，掩蓋了細胞分泌功能的異質(zhì)性。因此單個因子的檢測濃度高低，往往不能很好預(yù)測患者免疫治療的療效。

IsoPlexis單細胞功能蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)開創(chuàng)性地實現(xiàn)了單細胞水平對直接發(fā)揮功能的活細胞分泌蛋白組進行全自動檢測，通過微流控芯片捕獲單細胞、進行活細胞培養(yǎng)、逐一檢測每個單細胞分泌的多達32種細胞因子，通過生信軟件自動數(shù)據(jù)分析和可視化。對比分析免疫細胞亞群的細胞因子分泌差異，將不同細胞因子種類和信號強度關(guān)聯(lián)到相應(yīng)細胞功能，研究免疫細胞亞群功能異質(zhì)性和多功能性，找到在免疫應(yīng)答反應(yīng)中具有作戰(zhàn)能力的“超級英雄細胞"，并生成特別的“細胞多功能指數(shù)（PSI）"，更全面地分析免疫細胞的綜合功能。單細胞功能蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，成為免疫治療研究中生物標志物探索的有利新工具。

IsoCode 單細胞適應(yīng)性免疫應(yīng)答panel

單細胞分泌蛋白組學(xué)提供的數(shù)據(jù)

以德克薩斯大學(xué)MD安德森癌癥中心Adi Diab等發(fā)表在Journal of Clinical Oncology的文章為例：在BEMPEG（改造的偏向性IL-2受體激動劑）+ Nivo（PD-1單抗）聯(lián)合治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤II期臨床研究中，研究者在用藥前后不同周期采集患者外周血PBMC，通過IsoPlexis單細胞功能蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測CD4+T、CD8+T細胞的細胞因子分泌譜，包括發(fā)揮免疫效應(yīng)功能、免疫刺激作用、趨化作用、免疫調(diào)節(jié)、炎癥相關(guān)功能的五大職能32種細胞因子的檢測分析。回顧性分析與患者預(yù)后和療效相關(guān)的生物標志物，包括：

• 應(yīng)答組和非應(yīng)答組受試者治療前（C1D1）、治療后（C1D8）外周血CD8+T細胞分泌因子差異分析；

  治療一周后，應(yīng)答組細胞因子分泌多樣性更高，多因子組合的分泌頻率更高（橫向條塊顏色越深，比例越高），主要由具有效應(yīng)功能的細胞因子所驅(qū)動，其他趨化性、刺激性和調(diào)節(jié)性細胞因子也有不同程度的貢獻；

CD8+T細胞分泌因子譜多功能熱圖

• 根據(jù)細胞因子分泌差異，分析應(yīng)答組和非應(yīng)答組受試者治療前（C1D1）、治療后（C1D8）外周血CD8+T細胞多功能性（可分泌多種因子的細胞占比）；

  治療一周后，應(yīng)答組多功能性CD8+T細胞增多；

CD8+T多功能細胞比例

• 分析應(yīng)答組和非應(yīng)答組受試者治療前（C1D1）、治療后（C1D8）外周血CD8+T細胞多功能指數(shù)（結(jié)合多功能細胞比例及其分泌的各種因子的信號強度）；

  治療緩解組（CR+PR）患者的CD8+ T細胞的PSI升高約2.2倍，具有顯著差異（P＜0.01）；

CD8+T單細胞多功能指數(shù)（PSI）

細胞多功能指數(shù)（PSI），是結(jié)合多功能細胞比例及其分泌的各種因子的信號強度的綜合評價指標。

• 治療后與基線樣本配對分析，外周血免疫細胞PSI中值變化倍數(shù)（PSD）；

  CD8+T細胞PSD與客觀緩解率（ORR）顯著相關(guān)，可成為與患者應(yīng)答呈正相關(guān)的預(yù)測性血液生物標志物；

• 長期隨訪，分析PSD（ PSI中值變化倍數(shù)）與患者無進展生存期（PFS）的關(guān)系；

  在為期3年的研究過程中，CD8+T細胞PSD高的患者表現(xiàn)出更好的遠期預(yù)后效果，或治療結(jié)果改善。

本研究證明了BEMPEG + Nivo聯(lián)合免疫療法治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的有效性和安全性，IsoPlexis的細胞多功能指數(shù)（PSI）及其變化倍數(shù)（PSD）是有效預(yù)測患者總體緩解率的關(guān)鍵指標。

IsoPlexis平臺分析的預(yù)測性血液生物標志物，使研究人員能夠比以前的傳統(tǒng)技術(shù)更早地評估患者對Nivo/Bempeg治療的反應(yīng)。加速對難治性癌癥的洞察，如轉(zhuǎn)移性黑素瘤，鑒別與患者持久反應(yīng)相關(guān)的治療。

IsoPlexis單細胞功能蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，正在被越來越多的研究者選擇，在腫瘤免疫療法開發(fā)和臨床研究中，幫助研究者進行相關(guān)生物標記物的檢測分析，揭示患者臨床獲益或耐藥相關(guān)的機制，以更好地實現(xiàn)精準治療從而選擇最為適合的治療方案。

IsoPlexis在腫瘤免疫臨床

和臨床前研究中的代表文獻