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介紹蛋白質(zhì)定量分析常用的兩種方法

2023-2-27  閱讀(685)

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  蛋白質(zhì)的定量分析主要依靠蛋白質(zhì)本身的發(fā)色基團(tuán),或與其它顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生的紫外吸收來進(jìn)行的。目前常用的蛋白質(zhì)的定量主要有紫外線吸收法、Bradford法及BCA法等。
  隨著質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展,利用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)(組)的定性和定量分析得到更為廣泛的應(yīng)用和研究。
  1.蛋白質(zhì)定性分析:確定樣品中是否有蛋白質(zhì)存在,以及存在的是何種蛋白質(zhì)。
  蛋白質(zhì)定性分析通常是指利用質(zhì)譜法進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定和序列分析。蛋白質(zhì)定性分析分為top-down分析和bottom-up分析兩種策略。目前,bottom-up分析策略被更廣泛的應(yīng)用于蛋白質(zhì)定性分析工作。
  Bottom-Up(自底向上)和Top-Down(自頂向下)兩種策略“自底向上”策略是指通過分析由蛋白質(zhì)酶解生成的肽段來鑒定蛋白質(zhì)。“自頂向下”策略直接鑒定完整蛋白質(zhì),在翻譯后修飾和蛋白質(zhì)同素異構(gòu)體鑒定方面有一些潛在的優(yōu)勢。可是該策略的缺陷是蛋白質(zhì)在氣相中分離、電離及碎裂都十分困難。而蛋白質(zhì)組學(xué)由于將蛋白質(zhì)酶解成肽段,使其在氣相中更容易被分離、電離和碎裂。
  2.蛋白質(zhì)定量分析:確定樣品中總蛋白含量,或者某種單一蛋白成分的含量。
  蛋白質(zhì)相對定量分析
  相對定量的目的是測定目的蛋白在兩個或多個樣本中的表達(dá)量的相對比例,而不需要知道它們在每個樣本中的表達(dá)量。例如,如果研究項(xiàng)目中包括處理過的和未經(jīng)處理的對照樣本,通??梢詫⑽唇?jīng)處理的樣本做為對照組,經(jīng)處理的樣本的定量結(jié)果除以對照樣品的定量結(jié)果,就可以計算各個處理樣本的蛋白含量相對于對照組樣品的百分比。
  蛋白質(zhì)絕對定量分析
  目前基于質(zhì)譜的絕對定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要是指靶向蛋白質(zhì)組學(xué)。靶向蛋白質(zhì)組學(xué)分析,是指對目標(biāo)蛋白質(zhì)(或修飾肽段)進(jìn)行定性和/或定量分析,或者用于驗(yàn)證大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果。基于質(zhì)譜的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法,由于沒有物種限制并具備多目標(biāo)同時分析能力等優(yōu)勢,受到越來越多的關(guān)注和應(yīng)用。其技術(shù)方法經(jīng)歷了從傳統(tǒng)的SRM/MRM(選擇性/多反應(yīng)監(jiān)視,selected/multiple reaction monitoring)到PRM(平行反應(yīng)監(jiān)視,parallel reaction monitoring)的發(fā)展歷程。
  絕對定量蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用方向:驗(yàn)證定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果、驗(yàn)證翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果、目標(biāo)蛋白質(zhì)絕對/相對定量分析、診斷標(biāo)志物靶向篩選、診斷標(biāo)志物驗(yàn)證與絕對定量、驗(yàn)證基因表達(dá)產(chǎn)物。

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