細(xì)胞因子

疑惑解答

逐典細(xì)胞因子優(yōu)勢(shì)

1.非標(biāo)簽純化

2.特異性強(qiáng)，純度高

3.全面覆蓋各類細(xì)胞培養(yǎng)所需

4.規(guī)格可根據(jù)需求定制

5.GMP和科研級(jí)別均可提供

6.具有改良型產(chǎn)品：IL-2 Pro擁有更高溶解度，IL-15 Pro 擁有更高活性

細(xì)胞因子(cytokine，CK)是由多種組織細(xì)胞(主要為免疫細(xì)胞)所合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白。細(xì)胞因子能介導(dǎo)細(xì)胞間的相互作用，具有多種生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化成熟、功能維持、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、參與炎癥反應(yīng)、創(chuàng)傷愈合和腫瘤消長(zhǎng)等。

常見(jiàn)問(wèn)題

問(wèn)：常見(jiàn)細(xì)胞因子有哪些？有什么功能？

答：(1) 白細(xì)胞介素（interleukin, IL)：由淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞或其它非單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，在細(xì)胞間相互作用、免疫調(diào)節(jié)、造血以及炎癥過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用，凡命名的白細(xì)胞介素的cDNA基因克隆和表達(dá)均已成功，已報(bào)道有三十余種（IL-1―IL-38）。

(2) 集落刺激因子（colony stimulating factor, CSF)：根據(jù)不同細(xì)胞因子刺激造血干細(xì)胞或分化不同階段的造血細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基中形成不同的細(xì)胞集落，不同CSF不僅可刺激不同發(fā)育階段的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞增殖的分化，還可促進(jìn)成熟細(xì)胞的功能。

(3) 干擾素（interferon, IFN)各種不同的IFN生物學(xué)活性基本相同，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用。

(4) 腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF)：兩類TNF基本的生物學(xué)活性相似，除具有殺傷腫瘤細(xì)胞外，還有免疫調(diào)節(jié)、參與發(fā)熱和炎癥的發(fā)生。大劑量TNF-α可引起惡液質(zhì)，因而TNF-α又稱惡液質(zhì)素（cachectin)。

問(wèn)：細(xì)胞因子凍干產(chǎn)品的使用要注意什么？

答：凍干粉產(chǎn)品在運(yùn)輸過(guò)程中會(huì)有粉末黏在管壁或蓋上，使用前請(qǐng)勿開(kāi)蓋并離心處理 20-30 秒（高速離心機(jī)，約13000 rpm），使附于管蓋或管壁的蛋白收集于管底。亦可使用最高轉(zhuǎn)速為4000-4500rpm的離心機(jī)離心5分鐘（3000-3500rpm），也能達(dá)到類似的效果。雖然有時(shí)管中蛋白粉末不可見(jiàn)或者可視數(shù)量很少，我們的質(zhì)控體系保證每管中所含的蛋白量是準(zhǔn)確且足量的。

問(wèn)：細(xì)胞因子凍干產(chǎn)品如何溶解？

答：(1) 使用前準(zhǔn)備：使用前先離心（見(jiàn)上文），使附于管蓋或管壁的蛋白沉于管底；

(2) 溶解液

①　要求用無(wú)菌去離子水溶解的產(chǎn)品，務(wù)必不可用鹽溶液，避免過(guò)高的鹽濃度造成蛋白不可逆的析出；不可用PBS或培養(yǎng)液（1640或DMEM等）直接溶解，否則蛋白可能無(wú)法溶解，從而導(dǎo)致蛋白活性不足或失活；

②　要求用鹽溶液溶解的產(chǎn)品，請(qǐng)依照說(shuō)明書(shū)上的濃度，同樣也是為了避免過(guò)高的鹽濃度；

③　亦可聯(lián)系我們的技術(shù)支持獲得關(guān)于單獨(dú)產(chǎn)品的溶解液的選擇。

(3) 溶解到濃度：

①　我們建議最佳濃度一般不低于100 μg/mL，如10μg的凍干粉，則加入10 μL-100μL的溶解液；

②　高于或低于最佳濃度，細(xì)胞因子可能會(huì)不穩(wěn)定，或者聚集（aggregation），導(dǎo)致部分蛋白沉淀，影響其活性。高于這個(gè)濃度范圍，可能會(huì)超過(guò)該蛋白的最大溶解濃度，即蛋白無(wú)法溶解；

③　用移液槍輕吹混勻，或?qū)⒐苌w蓋好后輕柔顛倒數(shù)次進(jìn)行混勻，低速離心數(shù)秒；溶解時(shí)不可振蕩（vortex，即用渦旋儀進(jìn)行快速振蕩），避免因化學(xué)鍵的斷裂造成蛋白失活；

④　將溶解后的蛋白在室溫放置數(shù)分鐘，以保證蛋白能夠充分溶解。建議將不易溶解（slow to dissolve）的蛋白用低速搖床促進(jìn)其溶解。

(4) 溶解后的保存：

不建議用推薦的溶解液做進(jìn)一步稀釋。溶液中的蛋白很容易黏附在凍存管壁，且很難與管壁分離。使用含有載體蛋白的溶液（該溶液通常是指pH近中性，有一定緩沖能力的緩沖液，如PBS，培養(yǎng)液等）預(yù)先封閉塑料管壁上的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，使細(xì)胞因子或重組蛋白不會(huì)黏于管壁，方可更好地保存蛋白溶液；

①　短期保存：在一般情況下，上文中建議的濃度是較高的。我們建議將該溶液用含載體蛋白（如0.1% BSA、10% FBS、5% HSA）的溶液進(jìn)行稀釋，分裝存于4℃并于一周內(nèi)用完，分裝體積不要小于20μL。否則稀釋后的細(xì)胞因子或重組蛋白很容易會(huì)粘附在管壁或瓶壁上，使得溶液中的細(xì)胞因子或重組蛋白的濃度下降，從而影響其生物活性；

②　長(zhǎng)期保存：若配置的溶液無(wú)法一次用盡，我們建議用含載體蛋白（如0.1% BSA、10% FBS、5% HSA）的溶液進(jìn)一步稀釋，分裝凍存于-20℃至-80℃，分裝體積不要小于20μL；

③　在做無(wú)血清培養(yǎng)或動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，細(xì)胞因子中不能含有BSA，F(xiàn)BS或HSA等動(dòng)物或人的成分，我們建議選用小包裝，每次使用一支，用后即廢棄。或者用含5%海藻糖（Trehalose）的溶液來(lái)稀釋已溶解的細(xì)胞因子或重組蛋白，然后分裝凍存，分裝體積不要小于20μL。

問(wèn)：重組蛋白的檢測(cè)都有哪些？

答：基因序列：經(jīng)N端序列分析。必要時(shí)，使用SDS-PAGE，HPLC和質(zhì)譜分析等方法與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)；

蛋白純度：

(1) 經(jīng)SDS-PAGE

(2) HPLC分析

生物活性：經(jīng)相關(guān)的體外或體內(nèi)生物活性檢測(cè)，詳見(jiàn)下文；

蛋白含量：

(1) 紫外分光光度

(2) BCA蛋白定量測(cè)定

(3) SDS-PAGE分析

(4) HPLC法與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)

內(nèi)毒素含量：經(jīng)動(dòng)態(tài)LAL（西方鱟試劑）法或TAL（東方鱟試劑）法測(cè)定；

無(wú)菌：所有蛋白溶液在分裝凍干前經(jīng)0.22um濾膜過(guò)濾除菌，在環(huán)境分裝、凍干及封蓋；

分子量：SDS-PAGE分析；

宿主蛋白殘留：熒光染色；

宿主DNA殘留：ELISA試劑盒；

支原體檢測(cè)：支原體試劑盒。

問(wèn)：重組蛋白的生物活性是什么？

答：蛋白質(zhì)的生物活性是各種蛋白質(zhì)功能的體現(xiàn)。或者您可以理解只有蛋白質(zhì)有活性的概念，它才能執(zhí)行它的功能。具有生物活性的蛋白質(zhì)稱為活性蛋白質(zhì)，即具有生物活性的活性蛋白質(zhì)。從理論上講，天然蛋白都是活性蛋白，而重組蛋白并不總是活性蛋白，因?yàn)橹亟M蛋白的產(chǎn)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其中許多因素對(duì)其生物活性至關(guān)重要，例如理想的表達(dá)系統(tǒng)、合適的表達(dá)載體、純化等。

1. ED50的計(jì)算：

逐典的蛋白產(chǎn)品ED50（即半數(shù)有效濃度，其定義是對(duì)特定細(xì)胞引起 50% 最大反應(yīng)的蛋白濃度，單位為ng/mL）可在蛋白產(chǎn)品COA中獲取，這種活性表示法僅適用于劑量反應(yīng)曲線呈 S 形的細(xì)胞因子。將1 ng/mL ED50 定義為 1 unit，則產(chǎn)品生物學(xué)活性 Specific Activity 的換算公式如下：

Specific Activity（units/mg）= 1 × 10 6 ÷ ED50（ng/mL）

以上計(jì)算公式并不適用于International Units（IU）和ED50的換算關(guān)系，我們建議采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比相同實(shí)驗(yàn)獲得該蛋白的IU值。

2. 影響ED50的因素：

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中的實(shí)驗(yàn)方案只是確認(rèn)該產(chǎn)品的ED50，如果客戶的實(shí)驗(yàn)類型與我們相同，則可以按照產(chǎn)品標(biāo)定的生物活性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；若實(shí)驗(yàn)采用了不同的細(xì)胞種類或方法，我們建議客戶按照梯度濃度通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得最佳ED50值，并依據(jù)此數(shù)值制定相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方案以及產(chǎn)品的添加量。