體內(nèi)藥效評價&藥理學(xué)研究

抗腫瘤藥物藥效學(xué)評價

抗腫瘤藥物藥效學(xué)評價是小動物光學(xué)成像技術(shù)的基礎(chǔ)應(yīng)用之一，利用熒光素酶標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，并移植入動物體內(nèi)建立腫瘤疾病動物模型，給藥后應(yīng)用小動物活體光學(xué)成像技術(shù)觀測腫瘤光學(xué)信號隨時間的變化情況，進(jìn)而評價不同藥物、特定的給藥途徑、時間、劑量等給藥策略對于腫瘤的治療效果，如下圖就利用小動物活體光學(xué)成像技術(shù)評價了PD-0332991(PD-991)、阿瓦斯?。ˋvastin）、多西他賽（docetaxel，TXT）的抗腫瘤效果。

利用螢火蟲熒光素酶標(biāo)記MDA-MB-435乳腺癌細(xì)胞株，將細(xì)胞注入小鼠腎包膜下構(gòu)建腎包膜腫瘤模型，進(jìn)而對3種不同藥物或不同劑量的治療效果進(jìn)行評價。（A,C）應(yīng)用IVIS成像系統(tǒng)長期觀測3種藥物對腎包膜乳腺癌移植瘤的治療效果，并進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示30 mg/kg Docetaxel（TXT）對腫瘤的生長抑制效果好；（B,D）應(yīng)用IVIS成像系統(tǒng)長期觀測3種藥物對腎包膜乳腺癌移植瘤肺部轉(zhuǎn)移的抑制效果，并進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示30 mg/kg Docetaxel（TXT）對腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制效果好。

Zhang et al.,Clin Cancer Res.2009;15(1):238-46.

利用生物發(fā)光成像技術(shù)進(jìn)行藥效評價的另一優(yōu)勢在于，可以明確判斷藥物是否有效殺死腫瘤活細(xì)胞。這是由于生物發(fā)光的原理是基于活細(xì)胞環(huán)境的酶促反應(yīng)，因此，能夠發(fā)光的細(xì)胞必定是具有活性的。下圖所示為輝瑞公司抗腫瘤藥物Sutent的部分研究結(jié)果，研究人員首先利用卡尺測量腫瘤體積的方法觀測該藥物對于腫瘤的生長抑制情況，發(fā)現(xiàn)該藥物能夠延緩腫瘤的生長，但體積測量數(shù)據(jù)顯示腫瘤并未變小，研究人員隨后利用生物發(fā)光成像技術(shù)進(jìn)行觀測，發(fā)現(xiàn)給藥一定時間后腫瘤光學(xué)信號顯著降低，說明該藥物對腫瘤活性細(xì)胞確實具有殺傷作用，同時說明單獨依靠腫瘤體積測量的方式無法準(zhǔn)確真實反映藥物治療效果。憑借活體光學(xué)成像的實驗結(jié)果，Sutent得以順利通過FDA的認(rèn)證。

IVIS Lumina III小動物光學(xué)活體成像系統(tǒng)

該系統(tǒng)進(jìn)一步優(yōu)化了熒光二維成像性能，將濾光片標(biāo)準(zhǔn)配置數(shù)量增加至26個，引入了作為熒光多光譜成像金標(biāo)準(zhǔn)的純光譜分析技術(shù)（CPS），使得Lumina III成為同時擁有生物發(fā)光及熒光二維成像金標(biāo)準(zhǔn)的高性能活體成像平臺。

• 高靈敏度生物發(fā)光二維成像

• 高性能熒光二維成像,配備高品質(zhì)濾光片及光譜分離算法，可實現(xiàn)自發(fā)熒光扣除及多探針成像

• 生物發(fā)光及熒光成像模式聯(lián)合使用

• 基于切倫科夫輻射原理的放射性同位素成像

D-螢光素鉀鹽

來自逐典的D-螢光素是常用和多功能的生物發(fā)光底物。利用熒光素基因標(biāo)記細(xì)胞，注射熒光素底物后檢測熒光強(qiáng)度，可實時監(jiān)測目的細(xì)胞的生長狀況與藥物使用效果。

小動物活體光學(xué)成像實驗流程，主要分為：

1，選擇合適的熒光素酶；

2，進(jìn)行載體構(gòu)建

3，建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系；

4，細(xì)胞注射動物；

5，注射底物；

6，進(jìn)行活體成像

螢火蟲螢光素酶標(biāo)記腫瘤細(xì)胞株的構(gòu)建可以采用電轉(zhuǎn)染方式。

Lonza Nucleofector核轉(zhuǎn)系統(tǒng)

Nucleofector技術(shù)是—種基于通過施加電脈沖在細(xì)胞膜中瞬間產(chǎn)生小孔，綜合各種Nucleofector嚴(yán)程序和細(xì)胞類型特異性電轉(zhuǎn)試劑，使核酸底物不僅可以輸送到細(xì)胞質(zhì)，還可以通過核膜進(jìn)入細(xì)胞核。這使得細(xì)胞最高轉(zhuǎn)染效率可達(dá)99%，并使轉(zhuǎn)染成功不依賴千細(xì)胞的增殖分裂。無論是原代細(xì)胞、干細(xì)胞、還是細(xì)胞系，它每次都可重復(fù)出很高的轉(zhuǎn)染效率，更高效篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞珠。

藥物分布靶向研究

除了在藥效學(xué)中的應(yīng)用，小動物活體光學(xué)成像也廣泛應(yīng)用于藥物在體內(nèi)靶向、分布及代謝的研究。與藥效學(xué)中的應(yīng)用不同，此類應(yīng)用是以藥物為直接觀測對象，因此標(biāo)記方式通常是利用熒光探針直接標(biāo)記藥物本身，通過追蹤熒光信號而反映藥物在體內(nèi)的分布情況。如在研究抗體或多肽類藥物是否能夠有效靶向腫瘤的實驗中，可以利用熒光染料通過化學(xué)鍵的結(jié)合標(biāo)記目標(biāo)抗體或多肽，經(jīng)尾靜脈注射后，利用小動物活體光學(xué)成像系統(tǒng)觀測上述標(biāo)記對象的腫瘤靶向性，如下圖：

上圖：利用VivoTag 645熒光染料標(biāo)記抗癌藥物曲妥珠單抗(Trastuzumab)，尾靜脈注入攜帶HER2陽性人卵巢癌SKOV3的SCID小鼠體內(nèi)，通過熒光成像觀測不同時間點藥物對腫瘤的靶向情況（左上圖后三列），腫瘤本身已被熒光素酶標(biāo)記而通過生物發(fā)光成像（左上圖最左列），右上圖為熒光定量分析結(jié)果，標(biāo)明曲妥珠單抗對HER2陽性的人卵巢癌SKOV3具有良好靶向性。

在研究藥物靶向的同時，了解不同時間點藥物在動物體各個器官的分布及最終代謝情況同樣。Revvity小動物活體熒光斷層成像系統(tǒng)可以很好的滿足此類應(yīng)用需求，能夠?qū)晒鈽?biāo)記的藥物在深層器官的分布進(jìn)行斷層掃描及三維重建，獲得真實準(zhǔn)確的三維定量數(shù)據(jù)，進(jìn)而對藥物的體內(nèi)分布代謝情況作出正確分析。如下圖：

上圖左：利用FMT 成像系統(tǒng)觀測不同時間點經(jīng)熒光染料VivioTag 680 標(biāo)記的BSA 在小鼠不同器官的分布； 上圖右：不同時間點不同器官BSA 分布的定量結(jié)果。

Revvity小動物活體成像系統(tǒng)Spectrum產(chǎn)品系列能夠進(jìn)行生物發(fā)光和熒光的三維重構(gòu)成像，從而更為有效地提供信號的深度、大小和精確定量的信息，更為嚴(yán)謹(jǐn)、全面地觀察小動物體內(nèi)生物學(xué)反應(yīng)，完成小動物活體成像系統(tǒng)從二維到三維成像、從相對定量到精確定量的飛躍。IVIS Spectrum CT同時具備功能性及結(jié)構(gòu)性成像功能，使研究人員能夠更全面的了解活體動物體內(nèi)復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象。

功能性成像包括:

(1)三維生物發(fā)光成像;

(2)三維熒光成像;

(3)三維切倫科夫成像:

結(jié)構(gòu)成像包括:

(1)活體動物斷層掃描功能;

(2)影像重建功能;

(3)適合進(jìn)行高通量成像;

(4)熒光多光譜成像;

CAR-T細(xì)胞藥物毒性研究

CAR-T細(xì)胞是通過識別并靶向腫瘤細(xì)胞表面抗原從而殺死腫瘤細(xì)胞。遺憾的是，CAR-T細(xì)胞針對的靶抗原多為腫瘤相關(guān)抗原（TAA），并非腫瘤細(xì)胞所的，在正常組織上也存在不同程度的表達(dá)。此時對靶抗原親和力和殺傷能力強(qiáng)的CAR-T細(xì)胞在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時也會攻擊正常組織，造成組織器官的損傷。

在FDA發(fā)布的《細(xì)胞治療臨床前動物實驗指南》中也提到， 需要使用適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ蛠眍A(yù)測臨床反應(yīng)。 然而多數(shù)情況下，因為靶抗原在跨物種反應(yīng)中存在差異性，目前用于CAR-T藥理試驗的動物模型，并不符合這一標(biāo)準(zhǔn)。因此，臨床前動物研究很難預(yù)測臨床潛在的不良反應(yīng)，同時會造成一種安全的假象。因此，急需一種在正常組織中表達(dá)人類靶點的動物模型， 來預(yù)測脫靶毒性，并提高免疫治療的安全性。

為了解決這個問題，Carl H. June教授團(tuán)隊開發(fā)了一種小鼠模型，該模型能夠在正常肝組織上穩(wěn)定可調(diào)的表達(dá)人類靶抗原。并以表達(dá)人表皮生長因子受體-2（Her2）為例展開了研究，同時比較了不同親和力CAR-T 細(xì)胞的抗腫瘤效果及毒性。相關(guān)結(jié)果發(fā)表在《JCI Insight.》期刊上。

研究人員設(shè)計了肝臟高/低抗原表達(dá)的兩組小鼠，注射相對高/低親和力的CAR-T細(xì)胞，隨后通過體重、血清樣本、臨床毒性信號及活體成像信號等指標(biāo)來評價不同親和力CAR-T的毒性反應(yīng)。結(jié)果顯示，在肝臟低Her-2表達(dá)的小鼠中，高親和力的CAR-T療法是非致死的，而異種排斥反應(yīng)才是主因(下圖B)。肝臟低表達(dá)小鼠的毒性降低，死亡率降低(下圖C)，親和調(diào)節(jié)的CAR-T的死亡率沒有顯著差異(圖C)，但高親和力CAR-T細(xì)胞更容易造成肝臟損傷（下圖D）及體重的降低（下圖E）。通過IVIS生物發(fā)光成像評估兩種親和力CAR-T細(xì)胞的豐度差異，結(jié)果顯示在陰性對照小鼠在注射T細(xì)胞后的前2周內(nèi)，CAR-T細(xì)胞的數(shù)量保持不變，表明缺乏抗原依賴性激活。在低抗原表達(dá)小鼠中，抗原識別時間延長，高親和力組保持激活時間更長?？偟膩碚f，低親和力 CAR-T細(xì)胞在該動物模型中能夠更好地區(qū)分低抗原密度和高抗原密度組織，表現(xiàn)出更好的安全性。

CAR-T非腫瘤靶向引起毒性評價