引言

基于細(xì)胞活性和毒性檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)在基礎(chǔ)研究中有廣泛的應(yīng)用，類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)也用于臨床前研究，以表征化合物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和副作用。相對(duì)于生物化學(xué)的方法，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛱峁└嗟纳硐嚓P(guān)數(shù)據(jù)，如細(xì)胞增殖，形態(tài)和信號(hào)通路等。

ATPlite 1step 化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)使用代謝活性細(xì)胞中的 ATP 作為細(xì)胞活力的標(biāo)志物。利用細(xì)胞凋亡和壞死時(shí) ATP 濃度降低這一方法監(jiān)測(cè)化合物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用是非常快速和靈敏的方法。

新面市的 VICTOR Nivo™ 多功能酶標(biāo)儀其整合了光吸收，化學(xué)發(fā)光，熒光強(qiáng)度，時(shí)間分辨熒光以及熒光偏正五種檢測(cè)模式。VICTOR Nivo™ 讀板器提供基于微孔板頂部和底部的檢測(cè)，底部檢測(cè)模式允許蓋板蓋，并在細(xì)胞相關(guān)的實(shí)驗(yàn)測(cè)定中實(shí)現(xiàn)更好的靈敏度。

材料和方法

在含有 10％ 胎牛血清 (FCS)，1％ 青霉素(100U / mL) /鏈霉素 (100μg/ mL) 的 Dulbecco's Modified Eagle 培養(yǎng)基 (DMEM) 中培養(yǎng)人肝細(xì)胞癌細(xì)胞 (HepG2，DSMZ no. ACC180) 2mM 谷氨酰胺。 將中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 (CHO-K1，DSMZ no.ACC 110) 放置在含 10％ FCS 和1％ 青霉素 (100U / mL) /鏈霉素 (100μg/ mL) 的 DMEM / F-12 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

ATPlite 1step 檢測(cè)方法：先將細(xì)胞潤(rùn)洗，胰蛋白酶消化后重懸于細(xì)胞培養(yǎng)基中并轉(zhuǎn)移至 384 孔板（每孔 25μl 細(xì)胞懸液）或 96 孔板（每孔 100μl 細(xì)胞懸液）。（推薦使用 PerkinElmer 白色細(xì)胞培養(yǎng)板 CulturPlate-384，＃6007680或 CulturPlate-96，＃6005680）

24h 后，用 DMSO (終濃度為 0.5％v / v) 溶解化合物 (秋水仙堿，5-氟嘌呤，Pac1) 并使用 Echo 液體處理系統(tǒng) 550 (Labcyte，Inc)加樣。在37℃，5％ CO2 條件下孵育 48 小時(shí)。將凍干的熒光素酶底物溶于 ATPlite 1step 緩沖液中，并在細(xì)胞中加入底物 (25μl/ 384 孔板，96 孔板/100μl )。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，在加入前將 ATPlite 試劑平衡至室溫。最后放入 VICTOR Nivo™ 酶標(biāo)儀讀數(shù)。測(cè)試步驟中需要預(yù)先將額外的 60s 振蕩步驟添加到發(fā)光檢測(cè)步驟 (ATPlite Luminescence) 中。最后使用 GraphPad Prism 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

結(jié)果

為了展示 VICTOR Nivo™ 酶標(biāo)儀和 ATPlite 1step 方法對(duì)化合物的細(xì)胞毒性檢測(cè)，我們研究了其方法的穩(wěn)定性，靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍。

圖 1 ATP 的標(biāo)準(zhǔn)曲線滴定檢測(cè)該方法的線性和動(dòng)態(tài)范圍。

圖 2 384 孔板中，細(xì)胞數(shù)目和檢測(cè)信號(hào)的相關(guān)性。

圖 3 96 孔板中，細(xì)胞數(shù)目和檢測(cè)信號(hào)的相關(guān)性。

圖 4 CHO-K1 細(xì)胞上的 DMSO 耐受結(jié)果。

圖 5 使用 CHO-K1 細(xì)胞，對(duì)秋水仙堿（A） ，5-氟尿嘧啶核苷（B），6-巰基嘌呤（C）的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)評(píng)估。

圖 6 采用 Z’ 表針該實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性

表 1 使用 CHO-K1 細(xì)胞，采用 ATPlite 1step luminescence assay 測(cè)試得到的 CV 和 z’。分別采用秋水仙素和 DMSO 做為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

結(jié)論

該研究展現(xiàn)了應(yīng)用 ATPlite 1step luminescence assay 以及 VICTOR NIVO™ 多模式酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞毒性的成功案例。VICTOR NIVO™ 一體化的安裝化學(xué)發(fā)光檢測(cè)模式適用于對(duì)應(yīng)的檢測(cè)方法并可靈活調(diào)整。

ATPlite 1step luminescence assay 簡(jiǎn)易性和穩(wěn)定性的優(yōu)勢(shì)有利于對(duì)應(yīng)的細(xì)胞系的條件優(yōu)化，動(dòng)態(tài)范圍和線性條件符合方法開(kāi)發(fā)的要求。高數(shù)值的 z’ 和低數(shù)值的誤差數(shù)據(jù)展現(xiàn)了該方法測(cè)試大量化合物的適用性。