Revvity小動物活體光學成像技術(shù)已在生命科學基礎研究、臨床前醫(yī)學研究及藥物 研發(fā)等領域得到廣泛應用。在眾多應用領域中，干細胞研究是活體光學成像技術(shù)的應用 熱點之一。在活體光學成像實驗中，常用于干細胞光學標記的方法包括：1、利用螢火 蟲熒光素酶（Firefly Luciferase）作為報告基因，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)體外轉(zhuǎn)染干細胞；2、 通過親脂性熒光染料直接標記干細胞；3、從已構(gòu)建好的生物發(fā)光轉(zhuǎn)基因動物中提取干 細胞，所提取干細胞即具備生物發(fā)光特性。總體來說，應用小動物活體光學成像技術(shù)進 行干細胞研究主要集中于以下幾個方面：1、監(jiān)測干細胞的移植、存活和增殖；2、示蹤 干細胞在體內(nèi)的分布和遷移；3、多能誘導干細胞、腫瘤干細胞等新興研究。下面結(jié)合 一些具體實例進行闡述：

一.監(jiān)測干細胞的移植、存活和增殖

干細胞移植在治療心肌缺血、脊髓損傷、關(guān)節(jié)炎等多種疾病中發(fā)揮重要作用。但是 迄今為止，科學家對干細胞在體內(nèi)的存活時間和增殖規(guī)律并未了解，而缺少有效的 技術(shù)手段是其中一個重要限制因素?；铙w光學成像技術(shù)可以長期連續(xù)監(jiān)測干細胞在活體 動物體內(nèi)的存活及增殖規(guī)律，為干細胞的研究提供了全新的技術(shù)支持。以下為應用生物 發(fā)光成像技術(shù)觀測干細胞在活體動物體內(nèi)存活和增殖的具體實例：

造血干細胞移植是現(xiàn)代生命科學的重大突破，通過移植造血干細胞可以治療惡性 血液病，部分惡性腫瘤，部分遺傳性疾病等多種致死性疾病。之前對于造血干細胞的 異體移植研究主要依靠流式細胞儀分析從處死的受體動物中提取的骨髓。這種方法雖然 能夠準確測量造血干細胞的移植存活率，但存在諸多缺陷：如需處死大批實驗動物；無 法反映除骨髓之外其他部位發(fā)生的造血重組情況；數(shù)據(jù)獲取只局限于處死動物后的單一 時間點，無法對同一個體的移植情況進行連續(xù)縱向觀測。生物發(fā)光成像技術(shù)很好的解決 了上述問題。發(fā)表于2003年Blood雜志上的一篇文獻利用了生物發(fā)光技術(shù)進行干 細胞異體移植的研究。作者觀察了不同造血干細胞（CD34+，CD34+CD38-）移植后，在 體內(nèi)表現(xiàn)出的不同增值規(guī)律：前者在移植8天后快速增殖，22天后細胞數(shù)量急劇下降； 后者移植后一直處于增殖狀態(tài)。研究者認為該技術(shù)是研究干細胞異體移植后的遷移和增 殖規(guī)律的有力工具，同時是研究不同細胞群體在體內(nèi)增殖不同表現(xiàn)的。

將生物發(fā)光標記的人造血干細胞 CD34+(A) 或CD34+CD38-(B)經(jīng)尾 靜脈移植入NOD/SCID小鼠體內(nèi)， 應用IVIS成像系統(tǒng)長時間觀測上 述細胞在小鼠體內(nèi)的存活及增殖 情況。

肌肉衛(wèi)星細胞（Adultmuscle satellite cells）是骨骼肌中位于肌細胞膜和基膜之間 的具有增殖分化潛力的肌源性細胞。它們在一般情況下處于靜息狀態(tài)，當被激活后， 具有增殖分化、融合成肌管、再形成肌細胞的能力。因此，肌肉衛(wèi)星細胞被認為是一 種干細胞，但衛(wèi)星細胞群的混合性質(zhì)意味著它們的干細胞身份難以證明。發(fā)表于2008 年Nature 上的一篇文獻通過利用生物發(fā)光成像技術(shù)證實衛(wèi)星細胞的確是干細胞、能夠 自我更新，從而澄清了相關(guān)問題。研究者將生物發(fā)光標記的單個肌肉衛(wèi)星細胞移植入 NOD/SCID 小鼠脛骨前肌中，4周后利用IVIS成像系統(tǒng)進行觀測，發(fā)現(xiàn)它能夠存活并 大量增殖，而且可以被再次移植。

應用干細胞進行疾病治療的一個重要前提是能夠成功接種干細胞，并且干細胞移植 后在受體動物體內(nèi)能夠穩(wěn)定存活。為此，科研人員一直致力于通過各種途徑提高干細胞 的在體存活率

在利用干細胞修復梗阻心肌的實驗中，通常是將相互離散的干細胞直接注入心肌 內(nèi)，這會很容易造成相互離散的干細胞由于注射點滲血或心臟收縮而被排出，以及射入 細胞的急性死亡，都會導致心肌內(nèi)干細胞的存留及存活率下降。2011年Biomaterials上 一篇文獻針對上述問題提出了解決方案。研究者摒棄了直接將相互離散的干細胞注入心 肌的方式，而是首先利用甲基纖維素水凝膠對生物發(fā)光標記的人羊水干細胞（hAFSC） 進行體外培養(yǎng)，使相互離散的干細胞形成球面對稱的細胞體，然后再將細胞體注入心肌。 結(jié)果顯示，與直接注射離散細胞相比，注射細胞體能夠有效提高干細胞的移植率和存活 率。導致這一結(jié)果的原因是細胞體相對于離散細胞具有更有效的物理體積，因而更容易 存留于心肌間隙，一旦進入心肌間隙，細胞體中富集的內(nèi)源性胞外基質(zhì)和粘附分子便可 提供良好的微環(huán)境使移植細胞存活于受體中。

另一篇文獻報道了利用生物材料提高干細胞的移植存活率。研究者將人工基質(zhì)膠 （Matrigel）、膠原蛋白（Collagen 1）、肽段水凝膠（Puramatrix）及上述三種物質(zhì)的混 合物分別與生物發(fā)光標記的骨髓間充質(zhì)干細胞混合接種于無胸腺裸鼠背部皮下，利用 IVIS 成像系統(tǒng)長時間觀測三種生物材料對干細胞體內(nèi)存活的影響。結(jié)果顯示，人工基質(zhì) 膠能夠明顯提高干細胞的移植存活率。原因可能是基質(zhì)膠中的基膜蛋白能夠釋放各種生 長因子，為細胞的增殖分化提供良好的微環(huán)境，同時基質(zhì)膠本身為細胞提供了支撐架構(gòu)。

二.示蹤干細胞在體內(nèi)的分布和遷移

干細胞移植后，活體示蹤干細胞的分布和遷徙具有重要意義。通過示蹤，不僅可以 直觀地了解其在體內(nèi)的分布，而且可以追蹤到其體內(nèi)的分化轉(zhuǎn)歸及調(diào)控機制。核素成像、 磁共振成像、光學成像等分子影像學技術(shù)的發(fā)展使干細胞活體示蹤成為可能。但通過放 射性核素或磁性顆粒標記干細胞進行活體示蹤時，由于核素的快速衰減或磁性顆粒無法 隨細胞分裂而保留等缺陷，導致無法在體內(nèi)對干細胞進行長期示蹤。而生物發(fā)光成像技 術(shù)是利用熒光素酶基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染干細胞，報告基因不隨干細胞的分裂或分化而丟失，因 此，利用這種技術(shù)可以長期穩(wěn)定地觀測干細胞在體內(nèi)的分布和遷移。

2007 年Stem Cell 上的一篇文獻即利用生物發(fā)光成像技術(shù)對骨髓間充質(zhì)干細胞靶向 遷移至受損心臟進行了長期觀測。研究者從生物發(fā)光轉(zhuǎn)基因小鼠中提取獲得具有生物發(fā) 光特性的骨髓間充質(zhì)干細胞，隨后經(jīng)尾靜脈注射入心臟缺血的同品系小鼠體內(nèi)，利用 IVIS 成像系統(tǒng)對干細胞的分布和遷移進行長達28天的活體觀測，發(fā)現(xiàn)干細胞會特異性 遷移至受損心臟并存留于心肌中發(fā)揮修復功能。

神經(jīng)干細胞增殖及遷移的缺陷是造成帕金森氏病等神經(jīng)退行性疾病的主要原因。神 經(jīng)干細胞起源于側(cè)腦室外側(cè)壁的室管膜下層區(qū)域（subventricular zone，SVZ）與海馬齒 狀回（dentate gyrus，DG），之后通過嘴側(cè)遷移流（rostral migratory stream，RMS）到 達嗅球（olfactory bulb，OB），進一步分化為中樞神經(jīng)細胞并融入現(xiàn)有的神經(jīng)通路。2008 年發(fā)表于Stem Cell上的一篇文獻報道了利用生物發(fā)光成像技術(shù)觀測神經(jīng)干細胞的上述 遷移情況。如下圖所示：

應用干細胞治療癌癥是腫瘤治療的新方法。進行干細胞腫瘤治療的前提是干細胞移 植后能夠靶向遷移至腫瘤細胞。應用活體光學成像技術(shù)能夠有效觀測干細胞在活體動物 體內(nèi)對腫瘤的靶向遷移。2009年發(fā)表于Stem Cell上的一篇研究結(jié)果即是一個很好的例 證。研究者分別利用海腎熒光素酶基因（Renilla Luciferase）及螢火蟲熒光素酶基因 （Firefly Luciferase），標記鼠乳腺癌細胞株4T1及人骨髓間充質(zhì)干細胞，利用IVIS成 像系統(tǒng)觀測經(jīng)尾靜脈移植的骨髓間充質(zhì)干細胞靶向乳腺癌腫瘤的情況，如下圖所示：

上述實例描述了應用熒光素酶基因標記干細胞而對其在體內(nèi)的分布遷移進行長期 示蹤，另一種用于標記干細胞的方式是過親脂性熒光染料（如DiD、DiR）直接標記干 細胞。相對于前種方式，應用熒光標記的方式示蹤干細胞只限于短期觀測，這是因為這 些親脂性熒光染料是通過嵌入細胞膜而標記細胞，因此無法隨細胞傳代，并且熒光染料 的發(fā)光強度也會逐漸減弱。但是，應用熒光染料進行標記，標記過程更易于操作，且具 有轉(zhuǎn)化醫(yī)學的應用潛力。因此，也有不少研究者通過這種方式監(jiān)測干細胞在體內(nèi)的分布 遷移情況。下述例子中，研究者利用 DiD 親脂性熒光染料標記人骨髓間充質(zhì)干細胞 （hMSC），將細胞腹腔注射入經(jīng)抗原誘導而患有關(guān)節(jié)炎的無胸腺大鼠中，應用IVIS成 像系統(tǒng)觀測hMSC在體內(nèi)的分布及遷移。結(jié)果顯示，注射后早期，hMSC主要富集于腹 腔，而隨著時間的延長，細胞逐漸遷移至患有關(guān)節(jié)炎的踝關(guān)節(jié)處。

三.新興研究

活體光學成像技術(shù)在傳統(tǒng)意義干細胞的研究中已得到廣泛應用。隨著干細胞研究程 度的深入，研究者已開始將該技術(shù)應用于干細胞的一些新興研究領域，如誘導性多能干 細胞（Induced Pluripotent Stem Cells，iPSCs）及腫瘤干細胞（Cancer/Tumor Stem Cell， CSC/TSC）的研究。

誘導性多能干細胞研究

誘導性多能干細胞最初是日本科學家山中申彌（Shinya Yamanaka）于2006年利用 病毒載體將四個轉(zhuǎn)錄因子（Oct4, Sox2, Klf4 和c-Myc）的組合引入小鼠成纖維細胞中， 使其重編程而得到的類似胚胎干細胞的一種細胞類型。雖然將誘導性多能干細胞應用于 臨床治療仍存在諸多不確定因素（如致癌副作用、自體免疫排斥等），但相對于在胚胎 干細胞應用中產(chǎn)生的倫理爭議，誘導性多能干細胞由于是對成體細胞進行重編程而獲 得，因此不存在這方面的問題，使其應用前景更為光明。

近年來，研究者已陸續(xù)開始利用小動物活體光學成像技術(shù)進行誘導性多能干細胞的 相關(guān)研究。發(fā)表于2009年Circulation 的一篇文獻報道，將經(jīng)熒光素酶標記的由小鼠成 纖維細胞誘導獲取的誘導性多能干細胞，移植入免疫缺陷型裸鼠或具有免疫活性的同種 異體小鼠皮下，發(fā)現(xiàn)在后者中不會形成畸胎瘤。進一步的研究顯示將誘導性多能干細胞 移植入發(fā)生急性心肌梗塞的具有免疫活性的同種異體小鼠心臟后，細胞的發(fā)展不會導致 畸胎瘤的形成，能夠穩(wěn)定存活，并能修復受損的心臟。

另一篇發(fā)表于2010年P(guān)NAS的文獻報道了應用IVIS成像系統(tǒng)觀測由iPS形成的神 經(jīng)球在脊髓損傷小鼠體內(nèi)的移植、存活和修復作用。

腫瘤干細胞研究

腫瘤干細胞研究 傳統(tǒng)觀念認為，腫瘤是由體細胞突變而成，每個腫瘤細胞都可以無限制地生長，但 這無法解釋腫瘤細胞似乎具有無限的生命力以及并非所有腫瘤細胞都能無限制生長的 現(xiàn)象。而腫瘤細胞生長、轉(zhuǎn)移和復發(fā)的特點與干細胞的基本特性十分相似，因此，有學 者提出腫瘤干細胞的理論，認為腫瘤中一小部分細胞具有自我更新、增殖和分化的潛能， 雖然數(shù)量少，卻在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)和轉(zhuǎn)移中起著重要作用。從本質(zhì)上講，腫瘤 干細胞通過自我更新和無限增殖維持著腫瘤細胞群的生命力；腫瘤干細胞的運動和遷徙 能力又使腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移成為可能；腫瘤干細胞可以長時間處于休眠狀態(tài)并具有多種耐 藥分子而對殺傷腫瘤細胞的外界理化因素不敏感，因此腫瘤往往在常規(guī)治療方法消滅大 部分普通腫瘤細胞后一段時間復發(fā)。這一理論為我們重新認識腫瘤的起源和本質(zhì)，以及 臨床腫瘤治療提供了新的方向。

近年來，研究者已陸續(xù)開始利用小動物活體光學成像技術(shù)進行腫瘤干細胞的相關(guān)研 究。在腫瘤干細胞的鑒定方面，研究者可利用活體光學成像技術(shù)在活體動物水平觀測某 些細胞的致瘤性，以確定該種細胞是否具備腫瘤干細胞的特性。如在2010年的一篇文 獻報道中，研究者利用熒光素酶通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式標記了乳腺癌細胞株HCC1954， 并利用流式細胞分選技術(shù)分離出帶有不同細胞表面標識物 CD24-/low/CD44+及 CD24+/CD44+的兩種細胞群，而CD24-/low/CD44+被報道存在于多種乳腺癌干細胞表面， 因此，研究者進一步將兩種細胞分別接種于NOD/SICD小鼠身體兩側(cè)的乳腺脂肪墊，利 用IVIS 成像系統(tǒng)觀測它們的致瘤性。結(jié)果顯示，帶有表面標識物CD24-/low/CD44+的細 胞其致瘤性明顯高于 CD24+/CD44+細胞，并且當細胞接種數(shù)量少于 100 個時，只有 CD24-/low/CD44+細胞具備致瘤性，說明帶有CD24-/low/CD44+的細胞群中可能富含腫瘤干 細胞。

傳統(tǒng)的化療藥物主要是通過篩選能殺滅分裂中腫瘤細胞的化合物，而腫瘤干細胞理 論認為，只要存在腫瘤干細胞，腫瘤就不可能治愈。所以，腫瘤治療的焦點是殺傷腫瘤 干細胞。但是腫瘤干細胞通常處于靜止狀態(tài)，只是在增殖時才開始快速分裂產(chǎn)生子細胞， 所以，按照傳統(tǒng)方法篩選出來的腫瘤治療藥物與殺滅腫瘤干細胞的要求差異巨大。2011 年發(fā)表于 Cell 的一篇文獻報道了根據(jù)神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞的增殖特性而利用針對性藥物 對腫瘤進行治療。研究者發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞的增殖依賴于一氧化氮合成酶 2 （NOS2），而普通神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞或正常神經(jīng)干細胞的增殖均不依賴NOS2，因此，研 究者設計出一個專門針對NOS2的抑制劑，此抑制劑能夠很好地穿過血腦屏障進入顱內(nèi) 移植的神經(jīng)膠質(zhì)瘤，并對熒光素酶標記的神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長具有明顯抑制效果。同時， 經(jīng)抑制劑處理的神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞其致瘤性也大幅降低。