基因治療是指將正常的或者有治療作用的遺傳物質(zhì)引入到患者體內(nèi)使其表達(dá)從而達(dá)到治療目的?；蛑委煹年P(guān)鍵是有效地將基因輸送到靶組織/細(xì)胞，這是通過基因遞送載體來實現(xiàn)的。腺相關(guān)病毒(AAV)載體是目前基因治療中病毒載體之一，因其具有免疫原性低、不整合到宿主基因組、能夠在體內(nèi)提供長期基因表達(dá)等優(yōu)點，在基因治療中顯示出巨大的潛力。

AAV是一種單鏈DNA(ssDNA)無包膜病毒，屬于細(xì)小病毒家族，直徑約25nm。目前有九種AAV血清型，每一種都有不同的嗜性，包括視網(wǎng)膜、肺、肌肉、肝臟和腦細(xì)胞。該病毒只由蛋白質(zhì)和DNA組成，其衣殼由衣殼蛋白VP1、VP2和VP3以 5：5：50的比例構(gòu)成。

在AAV藥物早期開發(fā)階段，需要在多個工藝步驟中多次對AAV載體進(jìn)行定量從而不斷優(yōu)化工藝生產(chǎn)高滴度病毒載體。傳統(tǒng)的檢測方法通常耗時多，效率低，自動化程度低。Revvity公司現(xiàn)推出可以定量檢測多種AAV血清型的HTRF和AlphaLISA試劑盒，具有操作簡單，樣本需求量少，線性范圍寬，可實現(xiàn)高通量等優(yōu)勢。產(chǎn)品列表如下：

部分驗證數(shù)據(jù)

HTRF AAV2 capsid detection

檢測范圍：4.35E+09–6.00E+11VP/mL

AlphaLISA AAV2 capsid detection

檢測范圍：4.5E+06–1.0E+11VP/mL

空殼率計算

在AAV載體的制造過程中，會產(chǎn)生三種衣殼，分別是：完整衣殼（full capsid）、部分衣殼（partial capsid）和空衣殼（empty capsid）。其中部分衣殼和空衣殼屬于生產(chǎn)中的雜質(zhì)，因此需要在整個生產(chǎn)過程中監(jiān)測空殼率。

在這里，我們介紹一種僅需要分別檢測衣殼和ssDNA的含量即可通過公式計算得到AAV樣品中完整衣殼（full capsid）百分比的新方法。

所需材料

1. 已知full capsid百分比的標(biāo)準(zhǔn)品（可購買商品化標(biāo)準(zhǔn)品）

2. 待測樣品

公式推導(dǎo)

由于partial capsid在純化樣品中的百分比小于1%, 為簡化后續(xù)計算，將它排除在分析之外。

N: number of AAV capsids in the sample

Ns: number of AAV capsids in the standard

f: full

e: empty

Rp: the ratio of the concentration (c) of proteins in the sample and standard

α: each capsid is composed of α μg of total proteins

RDNA: ratio for the concentration of ssDNA in the sample and standard

βs：the standard comes with a known percent of full capsids

通過以上公式換算便可得到樣本中full capsid的比例β

根據(jù)上述公式，我們可以通過運用HTRF或AlphaLISA的AAV定量試劑盒分別檢測樣本和標(biāo)準(zhǔn)品中衣殼數(shù)量，通過比值得到Rp。再通過LabChip、qPCR等其他ssDNA檢測手段分別檢測樣本和標(biāo)準(zhǔn)品中ssDNA的濃度，通過比值得到RDNA。這樣通過引入標(biāo)準(zhǔn)品采用比值法，便可以顯著降低不同檢測方法之間的不匹配度，得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果。