巨噬細(xì)胞在宿主防御和免疫過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在不同的微環(huán)境中，靜息巨噬細(xì)胞極化為M1（促炎）或M2（抗炎）巨噬細(xì)胞。M1巨噬細(xì)胞在感染或組織損傷期間會(huì)被脂多糖 （LPS） 激活，它們產(chǎn)生多種促炎細(xì)胞因子以及免疫反應(yīng)。通過(guò)分子生物學(xué)方法可以研究巨噬細(xì)胞不同狀態(tài)。然而，巨噬細(xì)胞在活體內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的行為仍然知之甚少。因此，開(kāi)發(fā)活化的M1巨噬細(xì)胞高度特異性的探針，能夠更好地了解巨噬細(xì)胞的功能和動(dòng)力學(xué)以及炎癥條件下治療干預(yù)的細(xì)胞反應(yīng)。

M1巨噬細(xì)胞進(jìn)行代謝重新編程，增強(qiáng)糖酵解，以促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生增加，響應(yīng)炎癥信號(hào)。尋找能夠介導(dǎo)巨噬細(xì)胞中糖酵解和M1極化的新靶點(diǎn)成為新成像技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵。N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR）是離子型谷氨酸受體，主要作用是控制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸可塑性。它們?cè)趯W(xué)習(xí)、記憶和神經(jīng)元成熟中起著重要作用。然而各種類型的人類癌癥和巨噬細(xì)胞中檢測(cè)到NMDAR的證據(jù)也越來(lái)越多，如NMDAR受體介導(dǎo)的鈣信號(hào)通路產(chǎn)生活性氧（ROS），導(dǎo)致巨噬細(xì)胞中COX-2表達(dá)增強(qiáng)。這也提示NMDAR如何在M1巨噬細(xì)胞極化中發(fā)揮作用，以及它們是否可以應(yīng)用于監(jiān)測(cè)各種炎癥性疾病的炎癥反應(yīng)是值得研究的。

首先，研究人員發(fā)現(xiàn)NMDAR在LPS處理的巨噬細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，隨后誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞極化。從機(jī)制上講，NMDAR介導(dǎo)Ca2+的積累，從而參與到LPS通過(guò)上調(diào)PI3K/AKT/mTORC1信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)行糖酵解。

基于NMDARs在M1巨噬細(xì)胞極化中的生物學(xué)相關(guān)性，研究人員認(rèn)為NMDARs可以成為炎癥性疾病中M1巨噬細(xì)胞分布動(dòng)態(tài)可視化的重要靶標(biāo)。通過(guò)引入NMDAR抗體和紅外熒光染料FSD Fluor™ 647，制備了NMDAR靶向成像探針NMDAR-FSD Fluor 647簡(jiǎn)稱為N-TIP。同時(shí)，為了進(jìn)行特異性研究也制備了同型對(duì)照兔IgG單克隆Isotype-FSD Fluor™™ 647簡(jiǎn)稱為I-TIP。

借助Operetta CLS的40倍水鏡進(jìn)行Z軸掃描，并利用Harmony 4.9軟件進(jìn)行3D重建和數(shù)據(jù)分析，建立體外分析方案。采用基于這種3D的成像技術(shù)，能夠可視化成像探針的細(xì)胞表面結(jié)合來(lái)確定N-TIP在LPS刺激的BMDM（鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞）細(xì)胞膜上的功能結(jié)合（下圖）。使用這種基于3D的成像方法，我們可以清楚地識(shí)別測(cè)試細(xì)胞的細(xì)胞膜（綠色）、細(xì)胞核（藍(lán)色）、細(xì)胞質(zhì)（白色）和特異性結(jié)合損傷的I-TIP或N-TIP（紅色）。當(dāng)應(yīng)用I-TIP時(shí)，在完整的BMDM和LPS刺激的BMDM中無(wú)法檢測(cè)到紅色信號(hào)。然而，在完整BMDM和LPS刺激的BMDM中都觀察到N-TIP結(jié)合損傷（紅色信號(hào)）。而且，LPS刺激的BMDM中的紅色信號(hào)明顯高于完整BMDM。隨后，研究人員也用流式進(jìn)行了驗(yàn)證。

基于N-TIP與M1極化巨噬細(xì)胞選擇性結(jié)合的發(fā)現(xiàn)，接下來(lái)評(píng)估了使用N-TIP作為活體小鼠炎癥反應(yīng)的新型顯像劑的可行性。對(duì)于炎癥模型，采用了LPS誘導(dǎo)的炎癥和CG誘導(dǎo)的炎癥，這在一些炎癥研究中被廣泛用。

LPS炎癥誘導(dǎo)后，通過(guò)靜脈注射給予小鼠N-TIP，并在時(shí)間測(cè)量體內(nèi)熒光。正如預(yù)期的那樣，在注射N-TIP后5小時(shí)，LPS注射的爪子中顯示發(fā)炎的病變，但在PBS注射的爪子中沒(méi)有。LPS誘導(dǎo)的發(fā)炎病變可觀察到至24h。然而，當(dāng)應(yīng)用I-TIP時(shí)，對(duì)照爪和LPS注射爪之間的FL信號(hào)沒(méi)有差異。

同樣，在CG誘導(dǎo)的炎癥的情況下，可以首先使用N-TIP在炎癥后5小時(shí)檢測(cè)發(fā)炎的病變，并持續(xù)到24小時(shí)。I-TIP無(wú)法區(qū)分對(duì)照和發(fā)炎病變。我們進(jìn)一步使用IVISense Cat B 680 FAST（一種用于檢測(cè)炎癥病變巨噬細(xì)胞的探針）和N-TIP進(jìn)行了體內(nèi)成像研究。用N-TIP觀察到的發(fā)炎病變與用IVISense Cat B 680 FAST觀察到的病變相當(dāng)，這表明NMDAR-flour 647可用于追蹤促炎性巨噬細(xì)胞。

之后，研究人員探討N-TIP介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞成像方法是否具有評(píng)估抗炎劑在活體小鼠中的治療效果的潛力。選取在臨床前和臨床中已被廣泛用于治療炎癥性疾病的DEX作為研究對(duì)象。建立CG誘導(dǎo)的炎癥，然后通過(guò)腹腔注射進(jìn)行DEX治療，以評(píng)估DEX的治療效果。在炎癥誘導(dǎo)后長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)的發(fā)炎病灶中檢測(cè)到強(qiáng)熒光信號(hào)。與對(duì)照小鼠相比，DEX處理顯著降低了發(fā)炎病變的熒光信號(hào)。進(jìn)一步證實(shí)了N-TIP的生物分布。與體內(nèi)研究結(jié)果一致，體外成像顯示CG注射的爪子中存在強(qiáng)烈的熒光信號(hào)且DEX處理的小鼠的顯著減少。

以上結(jié)果表明NMDAR介導(dǎo)的糖酵解在M1巨噬細(xì)胞相關(guān)炎癥中起著關(guān)鍵作用。并且，基于NMDAR開(kāi)發(fā)的靶向成像探針可能有助于體內(nèi)炎癥反應(yīng)的研究。瑞孚迪的高內(nèi)涵和活體成像的技術(shù)，提供給研究人員新的研究工具，從而在體外和活體內(nèi)對(duì)相關(guān)探針的效果進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。