導(dǎo)讀

藥物免疫毒性可以定義為非預(yù)期的免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)。免疫抑制可能導(dǎo)致宿主對(duì)傳染源或腫瘤細(xì)胞的抵抗力下降，而免疫增強(qiáng)可能會(huì)加劇自身免疫性疾病或過敏反應(yīng)。藥物誘導(dǎo)的全身免疫激活可導(dǎo)致與細(xì)胞因子過度釋放相關(guān)的嚴(yán)重反應(yīng)，也稱為細(xì)胞因子風(fēng)暴。由于免疫系統(tǒng)的功能具有高度的物種特異性，因此很難通過動(dòng)物研究來預(yù)測(cè)人類細(xì)胞因子的釋放。全血檢測(cè)在藥物開中屬于易于操作的體外解決方案。能快速簡(jiǎn)單地監(jiān)測(cè)人類細(xì)胞因子釋放，從而預(yù)測(cè)藥物的功效和安全性。相比基于PBMC的測(cè)定更科學(xué)、更便捷，不需要純化和分離細(xì)胞。少量血液（<5mL）足以測(cè)試多種實(shí)驗(yàn)條件。

研究?jī)?nèi)容

這項(xiàng)研究選擇免疫途徑和相關(guān)激動(dòng)劑來靶向Toll樣受體途徑、STING途徑或TCR激活途徑。最后通過HTRF定量人IL1β、IL2、IL6、IL8、TNFα和IFNγ。此外，將HTRF數(shù)據(jù)與ELISA參考試劑盒獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，以評(píng)估兩種技術(shù)之間的相關(guān)性。

來自3位不同獻(xiàn)血者的新鮮血液被收集在肝素管中，并且全血樣品均質(zhì)化后在RPMI中稀釋。將化合物分配到96孔板中，然后添加預(yù)稀釋的全血樣品。在37°C下孵育過夜，收集上清液，按表1所示稀釋全血上清液。最后使用HTRF或ELISA測(cè)量細(xì)胞因子。

表1：實(shí)驗(yàn)條件：U:未處理；H:HKLM；L:脂多糖；Z:酵母聚糖；R:R848；C:cGAMP；PI:PMA/離子霉素；PHA:植物血凝素；O/C:Okt3/抗CD28抗體

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

01

Toll樣1、2、4、6受體的激活

用HKLM、LPS或酵母聚糖刺激Toll樣受體途徑。下圖顯示了未處理樣品與處理樣品中每種測(cè)量細(xì)胞因子的濃度。HTRF解決方案能夠測(cè)定所有樣品中的基礎(chǔ)細(xì)胞因子水平（虛線）以及測(cè)量細(xì)胞因子分泌的增加。

02

STING通路的激活和T細(xì)胞受體途徑的激活

2,3cGAMP是STING途徑的特異性激活劑。激活后的細(xì)胞因子分泌譜顯示TNFα、IL1β和IL6顯著增加。相反，IFNα、IL2或IL8沒有顯著反應(yīng)（下圖）。圖6顯示OKT3/抗CD28刺激全血中的T細(xì)胞誘導(dǎo)輕微的IFNγ釋放，但未能誘導(dǎo)任何IL2產(chǎn)生。然而，對(duì)照條件PHA或PMA/離子霉素誘導(dǎo)IL2和IFNγ細(xì)胞因子的強(qiáng)烈增加。這些數(shù)據(jù)表明OKT3/CD28并沒有產(chǎn)生強(qiáng)烈T細(xì)胞特異性反應(yīng)。

03

HTRF和ELISA檢測(cè)之間的相關(guān)性

由于ELISA方法仍然是生物體液中細(xì)胞因子測(cè)量的傳統(tǒng)常用方法，因此本研究將HTRF獲得的細(xì)胞因子濃度與ELISA測(cè)定獲得的細(xì)胞因子濃度進(jìn)行比較。來自3個(gè)不同供體的全血樣本首先在地塞米松存在/不存在的情況下用R848（TLR 7/8激活）進(jìn)行刺激。通過HTRF或ELISA進(jìn)行R848+/-地塞米松處理后IL8釋放的測(cè)量，并確定兩種化合物的EC50或IC50。下圖顯示了HTRF和ELISA人IL8測(cè)定之間在164個(gè)樣品上獲得的相關(guān)性。在這里，研究證明了兩種檢測(cè)之間具有非常好的相關(guān)性，相關(guān)值r=0.993，比例偏差為0.77。

然后研究比較了通過HTRF和ELISA在3個(gè)不同供體上獲得的R848和地塞米松藥理劑量反應(yīng)（下圖）。結(jié)果表明，兩種方法測(cè)得的R848的EC50值或地塞米松的IC50值也非常接近（見表2）。

隨著免疫腫瘤學(xué)或代謝疾病等領(lǐng)域的研究和藥物發(fā)現(xiàn)的快速發(fā)展，監(jiān)測(cè)免疫系統(tǒng)對(duì)治療的反應(yīng)比以往任何時(shí)候都更加重要。全血檢測(cè)是一種用于評(píng)估對(duì)治療免疫反應(yīng)簡(jiǎn)單而強(qiáng)大的體外工具。HTRF細(xì)胞因子檢測(cè)具有免洗方案、低樣品消耗和廣泛的動(dòng)態(tài)范圍，與ELISA相比，可以增加測(cè)試化合物的數(shù)量，并快速獲得全血中細(xì)胞因子分泌的數(shù)據(jù)，為在生理環(huán)境中測(cè)試化合物創(chuàng)造了理想的方法平臺(tái)。