工作原理：

磷酸化 Rb（Ser807/811）檢測原理
磷酸化 Rb（Ser807/811）檢測用于測量在 Ser807/811 位點(diǎn)磷酸化的 Rb。與蛋白質(zhì)印跡法不同，該檢測基于微孔板，不需要凝膠、電泳或轉(zhuǎn)膜。磷酸化 Rb（Ser807/811）檢測使用兩種標(biāo)記抗體，一種帶有供體熒光團(tuán)，另一種帶有受體。第一種抗體因其對(duì)蛋白質(zhì)上磷酸化基序的特異性結(jié)合而被選擇，第二種抗體因其能夠識(shí)別不依賴于其磷酸化狀態(tài)的蛋白質(zhì)的能力而被選擇。蛋白質(zhì)磷酸化使得涉及兩種標(biāo)記抗體的免疫復(fù)合物形成，這使供體熒光團(tuán)與受體緊密接近，從而產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）信號(hào)。其強(qiáng)度與樣品中存在的磷酸化蛋白的濃度直接成正比，并在無需洗滌的檢測形式下提供了一種評(píng)估蛋白質(zhì)磷酸化狀態(tài)的方法。

 磷酸化 Rb（Ser807/811）雙板檢測方案：

雙板方案涉及在 96 孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，然后進(jìn)行裂解，接著將裂解物轉(zhuǎn)移到低體積檢測板（HTRF 384-lv 或 96-lv 板）中，之后加入 HTRF 磷酸化 Rb（Ser807/811）檢測試劑。該方案能夠監(jiān)測細(xì)胞的活力和融合度。 

磷酸化 Rb（Ser807/811）單板檢測方案：

使用 HTRF 試劑檢測磷酸化 Rb（Ser807/811）可以在一個(gè)用于培養(yǎng)、刺激和裂解的單板上進(jìn)行。無需洗滌步驟。這個(gè)為高通量篩選設(shè)計(jì)的方案能夠?qū)崿F(xiàn)微型化，同時(shí)保持強(qiáng)大的 HTRF 質(zhì)量。 

 檢測驗(yàn)證：

在 HCT-116 細(xì)胞中，CDK4/CDK6 抑制劑帕博西尼（Palbociclib）能有效抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白在 Ser807/811 位點(diǎn)的磷酸化。

HCT-116 細(xì)胞以 50 微升的體積接種在 96 孔板中（每孔 50,000 個(gè)細(xì)胞），使用培養(yǎng)基并在 37°C、5% 二氧化碳的條件下孵育。6 小時(shí)后，用不斷增加濃度的帕博西尼（另外添加 50 微升體積）處理細(xì)胞 19 小時(shí)。

移除培養(yǎng)基后，用 50 微升的補(bǔ)充裂解緩沖液在室溫下輕輕振蕩裂解細(xì)胞 30 分鐘，然后將 16 微升的裂解物轉(zhuǎn)移到低體積白色微孔板中，再加入 4 微升預(yù)混的 HTRF 磷酸化 Rb（Ser807/811）或總 Rb 檢測試劑。孵育 4 小時(shí)后記錄 HTRF 信號(hào)。

用Palbociclib（一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（Cdk4 和 Cdk6）抑制劑）處理會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白在酸 807/811 位點(diǎn)的磷酸化顯著降低，同時(shí)該蛋白的總量也會(huì)減少（正如 Liu 等人在 2017 年發(fā)表于《Plos》的文獻(xiàn)中所報(bào)道的那樣）。

 在人和小鼠細(xì)胞系上對(duì)磷酸化 Rb 細(xì)胞檢測的驗(yàn)證：

將 NIH 3T3、C2C12 和 HTC116 細(xì)胞以每孔 100,000 個(gè)細(xì)胞的密度接種在 96 孔板中。在 37°C、5% 二氧化碳的條件下孵育過夜后，移除細(xì)胞培養(yǎng)基，并向細(xì)胞中加入 50 微升裂解緩沖液。進(jìn)行裂解步驟，輕輕振蕩 30 分鐘。將 16 微升樣品轉(zhuǎn)移到 384 孔小體積板中，然后加入三種 HTRF Rb 檢測試劑中的每一種各 4 微升。4 小時(shí)后記錄信號(hào)。

兩種 HTRF 磷酸化檢測方法都與小鼠模型兼容。

 使用人HCT116 細(xì)胞的磷酸化 Rb Ser807/811 細(xì)胞檢測，將 HTRF 檢測與蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行比較：

人類 HCT116 細(xì)胞在 T175 培養(yǎng)瓶中于 5% 二氧化碳、37°C 下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到 80% 時(shí)，裂解細(xì)胞并通過離心收集可溶性上清液。對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行系列稀釋，將每種稀釋液的 16 微升轉(zhuǎn)移到 384 孔低體積白色微孔板中，最后加入磷酸化 Ser807/811 Rb 細(xì)胞檢測試劑盒試劑。并行比較顯示，HTRF 磷酸化檢測至少比蛋白質(zhì)印跡法靈敏 27 倍。

簡化的通路：

細(xì)胞分裂周期中的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白。

110kDa 的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白 Rb 屬于口袋蛋白家族，該家族還包括 p107 和 p130。

Rb 起著腫瘤抑制因子的作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程。

使該蛋白失活的突變會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤癌癥的發(fā)展，在這種情況下，視網(wǎng)膜細(xì)胞無法被替換，并受到高水平的致突變紫外線輻射。

在沒有有絲分裂信號(hào)的情況下，具有活性的低磷酸化 Rb 結(jié)合并抑制 E2F 轉(zhuǎn)錄因子，而 E2F 轉(zhuǎn)錄因子是進(jìn)入 S 期所必需的。

通過使 E2F 失活，Rb 將細(xì)胞維持在 G1 期，阻止細(xì)胞周期的進(jìn)程。

在有絲分裂信號(hào)存在的情況下，Rb 被細(xì)胞周期蛋白 D-CDK4/6 和細(xì)胞周期蛋白 E-CDK2 依化并失活。這種磷酸化事件誘導(dǎo) E2F 轉(zhuǎn)錄因子的釋放。

最后，E2F 激活諸如細(xì)胞周期蛋白、Cdk、胸苷激酶或 PCNA 等基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因在 DNA 合成和復(fù)制以及細(xì)胞分裂中起著至關(guān)重要的作用。