工作原理：
磷酸化 STAT3（Tyr705）檢測(cè)原理：
磷酸化 STAT3（Tyr705）檢測(cè)用于測(cè)量在 Tyr705 位點(diǎn)磷酸化的 STAT3。與蛋白質(zhì)印跡法不同，該檢測(cè)基于微孔板，不需要凝膠、電泳或轉(zhuǎn)膜。磷酸化 STAT3（Tyr705）檢測(cè)使用兩種標(biāo)記抗體：一種帶有供體熒光團(tuán)，另一種帶有受體。第一種抗體因其對(duì)蛋白質(zhì)上磷酸化基序的特異性結(jié)合而被選擇，第二種抗體因其能夠識(shí)別不依賴于其磷酸化狀態(tài)的蛋白質(zhì)的能力而被選擇。蛋白質(zhì)磷酸化使得涉及兩種標(biāo)記抗體的免疫復(fù)合物形成，這使供體熒光團(tuán)與受體緊密接近，從而產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）信號(hào)。其強(qiáng)度與樣品中存在的磷酸化蛋白的濃度直接成正比，并在無(wú)需洗滌的檢測(cè)形式下提供了一種評(píng)估蛋白質(zhì)磷酸化狀態(tài)的方法。

磷酸化 STAT3（Tyr705）雙板檢測(cè)方案：
雙板方案涉及在 96 孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，然后進(jìn)行裂解，接著將裂解物轉(zhuǎn)移到 384 孔低體積檢測(cè)板中，之后加入磷酸化 STAT3（Tyr705）HTRF 檢測(cè)試劑。該方案能夠監(jiān)測(cè)細(xì)胞的活力和融合度。

磷酸化 STAT3（Tyr705）單板檢測(cè)方案：
使用 HTRF 試劑檢測(cè)磷酸化 STAT3（Tyr705）可以在一個(gè)用于培養(yǎng)、刺激和裂解的單板上進(jìn)行。無(wú)需洗滌步驟。這個(gè)為高通量篩選設(shè)計(jì)的方案能夠?qū)崿F(xiàn)微型化，同時(shí)保持強(qiáng)大的 HTRF 質(zhì)量。

檢測(cè)驗(yàn)證：
使用磷酸化 STAT3 檢測(cè)進(jìn)行 HTRF 與蛋白質(zhì)印跡法的比較：
HeLa 細(xì)胞在 T175 培養(yǎng)瓶中于 37°C、5% 二氧化碳的條件下培養(yǎng) 2 天。用 5nM 的 IFNα 刺激 15 分鐘。移除細(xì)胞培養(yǎng)基，向細(xì)胞中加入 3ml 裂解緩沖液，然后孵育 45 分鐘。離心 10 分鐘后收集可溶性上清液。使用等量的裂解物對(duì)蛋白質(zhì)印跡法和 HTRF 進(jìn)行并行比較。這兩種方法顯示出相當(dāng)?shù)撵`敏度水平：750 個(gè)細(xì)胞。HTRF 比蛋白質(zhì)印跡法具有更高的便利性。

在 NIH 3T3 細(xì)胞上的 IL6 劑量反應(yīng)：
小鼠 NIH 3T3 細(xì)胞（每孔 100,000 個(gè)細(xì)胞）在 37°C 下用各種濃度的 IL6 刺激 30 分鐘。經(jīng)過(guò) 30 分鐘的裂解孵育時(shí)間后，使用 HTRF 磷酸化 STAT3（Tyr705）細(xì)胞檢測(cè)試劑盒的雙板檢測(cè)方案測(cè)量磷酸化的 STAT3。

JAK 抑制劑對(duì) HeLa 細(xì)胞的抑制作用：
HeLa 細(xì)胞（每孔 100,000 個(gè)細(xì)胞）在 37°C 下用各種濃度的拮抗劑孵育 1 小時(shí)。然后加入激動(dòng)劑（IFNα）并孵育 30 分鐘。經(jīng)過(guò) 30 分鐘的裂解孵育時(shí)間后，使用 HTRF 磷酸化 STAT3（Tyr705）細(xì)胞檢測(cè)試劑盒的雙板檢測(cè)方案測(cè)量磷酸化的 STAT3。

用 HTRF 總 STAT3 檢測(cè)來(lái)檢查 STAT3 的磷酸化狀態(tài)：
使用磷酸化 STAT3（Tyr705）和總 STAT3 檢測(cè)的雙板檢測(cè)方案，用 IFNα 激活 HeLa 細(xì)胞（每孔 100,000 個(gè)細(xì)胞）15 分鐘。獲得的結(jié)果顯示在 IFNα 刺激下 STAT3 磷酸化呈劑量反應(yīng)性增加，而 STAT3 的表達(dá)水平保持恒定。

簡(jiǎn)化的通路：
STAT3 在細(xì)胞因子受體信號(hào)通路中的作用：
響應(yīng)細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，STAT3 被受體相關(guān)激酶磷酸化，然后形成二聚體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，在那里它們作為轉(zhuǎn)錄激活因子起作用。STAT3 響應(yīng)細(xì)胞刺激介導(dǎo)多種基因的表達(dá)，因此在許多細(xì)胞過(guò)程中如細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡中起著關(guān)鍵作用。白細(xì)胞介素 6 家族細(xì)胞因子與 gp130 受體的結(jié)合通過(guò) JAK2 觸發(fā) STAT3 磷酸化。STAT3 也是其他受體如受體酪·激酶（EGFR、cmet.）和 c-src 的靶標(biāo)。