摘要有歷史記載以前，人們就已經(jīng)開始用草藥提取物治療疾病。同種植物常常因地域、氣候、生長(zhǎng)條件或亞種不同，具有不同形式的活性成分。中藥（TCM）中使用的一些植物就是例子。人參作為其中的代表，其亞種廣泛分布在整個(gè)亞洲和美洲大陸。本應(yīng)用報(bào)告報(bào)導(dǎo)了用 Agilent 1200 系列高分離度快速液相色譜系統(tǒng)，配置快速分離高通量（RRHT）柱，對(duì)復(fù)雜人參提取物中的組分進(jìn)行分離的方法。用 LC/ESI 八極加速飛行時(shí)間（oaTOF）和 LC/離子阱質(zhì)譜檢測(cè)并鑒別了地域或生物源性不同的人參所含化合物的差別?；谝阎慕M分結(jié)構(gòu)信息，通過(guò)測(cè)定組分譜圖可為人參制品的鑒定提供證據(jù)

摘要有歷史記載以前，人們就已經(jīng)開始用草藥提取物治療疾病。同種植物常常因地域、氣候、生長(zhǎng)條件或亞種不同，具有不同形式的活性成分。中藥（TCM）中使用的一些植物就是例子。人參作為其中的代表，其亞種廣泛分布在整個(gè)亞洲和美洲大陸。本應(yīng)用報(bào)告報(bào)導(dǎo)了用 Agilent 1200 系列高分離度快速液相色譜系統(tǒng)，配置快速分離高通量（RRHT）柱，對(duì)復(fù)雜人參提取物中的組分進(jìn)行分離的方法。用 LC/ESI 八極加速飛行時(shí)間（oaTOF）和 LC/離子阱質(zhì)譜檢測(cè)并鑒別了地域或生物源性不同的人參所含化合物的差別。基于已知的組分結(jié)構(gòu)信息，通過(guò)測(cè)定組分譜圖可為人參制品的鑒定提供證據(jù)

實(shí)驗(yàn)部分儀器• 帶脫氣機(jī)的 Agilent 1200 系列 SL 型二元泵。該泵能夠用 1.8 µm 粒徑 RRHT 柱進(jìn)行高分離 HPLC 分析，以獲得最佳分離性能• 帶溫度控制的 Agilent 1200 系列 SL 型高效自動(dòng)進(jìn)樣器(h-ALS SL)。該自動(dòng)進(jìn)樣器為配合 1200 系列 SL 型二元泵使用而特別設(shè)計(jì)，具有低的延遲體積• Agilent 1200 系列柱溫箱 (TCC)。該 TCC與 SL 型二元泵一起使用，在優(yōu)化的延遲體積條件下可選擇分離式熱交換器和柱后冷卻，并可選擇 2 位/10 通閥進(jìn)行交替柱再生• Agilent 1200 系列 SL 型二極管陣列檢測(cè)器 (DAD)。該 DAD 能以高達(dá) 80 Hz 的采樣速率采集數(shù)據(jù)，并具有內(nèi)置數(shù)據(jù)存儲(chǔ)功能• Agilent 6210 MSD TOF。八極加速飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，帶雙噴霧器接口以進(jìn)行質(zhì)量校正，能以最高的準(zhǔn)確性獲取分子質(zhì)量數(shù)。該飛行時(shí)間質(zhì)譜儀能以 40 Hz 速率采集數(shù)據(jù)，還能進(jìn)行正/負(fù)切換• Agilent 6330 離子阱，用于 MSn 串聯(lián)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)的離子阱質(zhì)譜儀，掃描速度高達(dá)每秒 26000 m/z，具有自動(dòng)數(shù)據(jù)自適應(yīng)MSn 功能• LC/離子阱儀器控制軟件為化學(xué)工作站B01.03，離子阱軟件 5.3，用離子阱數(shù)據(jù)分析軟件 3.3 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析• LC/TOF 儀器控制采用 Mass Hunter 工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，AnalystQS 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析• 色譜柱：ZORBAX SB-C18，2.1 x150 mm，1.8 µm

樣品1. 粉碎的凍干人參 (1 g) (Panax ginseng)和 粉 碎 的 凍 干 西 洋 參 (1 g) (Panaxquinquefolius) 分別加入 10 mL 甲醇，超聲處理 30 分鐘，過(guò)濾后直接分析2. 糖漿——如韓國(guó)人參提取物藥用制品(ILHWA Co., LTD, Korea) (1 g)溶解于100 mL 水/甲醇 (1/1，v/v)中，過(guò)濾后直接分析系統(tǒng)設(shè)置LC/MS液質(zhì)聯(lián)用儀 系統(tǒng)的設(shè)置如圖 1 所示。Agilent1200 系列 SL 型二元泵通過(guò)一根 0.17 mm內(nèi)徑不銹鋼毛細(xì)管與 Agilent 1200 系列h-ALS SL 連接。為減少延遲體積，h-ALSSL 的針座毛細(xì)管采用 0.12 mm 內(nèi)徑，用同樣規(guī)格的毛細(xì)管在柱溫箱中連接低延5989-5493EN 100遲體積(1.6µL)熱交換器，柱溫箱鏈接色譜柱。將 2 µL 流通池置于 SL 型 DAD 中用于 UV 檢測(cè)。出口毛細(xì)管直接連在 ESIoaTOF 或離子阱質(zhì)譜儀的電噴霧源噴霧器上。從人參（Panax ginseng）復(fù)雜天然產(chǎn)物提取物的 UV 分析可以看出，對(duì)儀器設(shè)置進(jìn)行了優(yōu)化以獲得最高分離度[5]。使用 2.1 x 150 mm，1.8 µm 色譜柱，系統(tǒng)反壓一般在 560 bar 左右。UV 色譜圖中基線分離的色譜峰最大峰寬（FWHM）小于0.1 分鐘。高分離配置的 Agilent 1200 系列二元泵系統(tǒng)的全部性能在另一篇應(yīng)用報(bào)告中介紹[7]。只要稍加改動(dòng)，這一系統(tǒng)也可以用于高通量分析[8]。

方法• Agilent 1200 系列 SL 型二元泵的操作條件如下：溶劑 A： 水 + 0.1% TFA溶劑 B： 乙腈+ 0.1% TFA流速： 0.5 mL/min梯度： 0 分鐘 5% B1 分鐘 5 % B60 分鐘 85 % B61 分鐘 95 % B70 分鐘 95 % B停止時(shí)間： 70 分鐘后運(yùn)行時(shí)間： 15 分鐘• 用 Agilent 1200 系列 SL 型高效自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣 10 µL 樣品，并將樣品冷卻到

合物。實(shí)驗(yàn)證明，在離子阱 MS 基峰色譜圖（圖 2 和圖 3）中，20 到 40 分鐘之間洗 脫 的 主 要 組 分 為 常 見 的 人 參 皂 甙Re、Rg1、Rb1、Rb2、Rc 和 Rd，以及特殊的人參皂甙 Rf 和 F11。1.8 µm 粒徑色譜柱除了具有良好的分離度以外，其分離度還可以隨溫度改善。例如，在 50 °C 柱溫下，所有人參樣品中都含有的人參皂甙 Rem/z 946.5 [M+H]+ 和人參皂甙 Rg1 m/z823.5 [M+Na]+ 分不開（圖 2），但在 80 °C時(shí)卻能分離（圖 3）。要用 LC/MS 區(qū)分人參和西洋參，異構(gòu)體人參皂甙 Rf 和偽人參皂甙 F11 非常有用。對(duì)人參的分析顯示，質(zhì)子化和加合形式的人參皂甙 Rf 分別在 m/z 801.5 和 m/z 823.5 處。在 m/z801.5 處的異構(gòu)體偽人參皂甙 F11 只能作為痕量化合物檢測(cè)（圖 3）。相反，西洋參中卻含有大量偽人參皂甙 F11 ，而不含人參皂甙 Rf。

兩種異構(gòu)體都有相同的經(jīng)驗(yàn)式 (C42H72O14)。這兩種化合物是構(gòu)造異構(gòu)體，只在結(jié)構(gòu)式上有區(qū)別。要區(qū)分這些種屬特異性化合物的異構(gòu)體形式，需要進(jìn)行 MS/MS 實(shí)驗(yàn)。西洋參樣品的離子阱MS/MS 實(shí)驗(yàn)表明，保留時(shí)間 28.5 分鐘的偽人參皂甙 F11 在 m/z 309.1 處斷裂為葡萄糖-鼠李糖二糖部分后，丟失 5 個(gè)水分子，依次在 m/z 475.4、457.4、439.3、421.3 和 403.3 處產(chǎn)生離子（圖 4）。最后在m/z 143.1 處產(chǎn)生特殊的呋喃環(huán)碎片。為了確證所提出的碎片結(jié)構(gòu)，我們用高分辨LC/MS oaTOF 高質(zhì)量精度測(cè)量和經(jīng)驗(yàn)式確證對(duì)該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了重復(fù)（圖 5）。以0.41 ppm 質(zhì)量精度測(cè)量 m/z 801.4997的精確質(zhì)量，確證了分子離子。以不到2 ppm 的質(zhì)量精度確證了連續(xù)丟失 5 個(gè)水分子產(chǎn)生的 m/z 475.3782、457.3676、439.3569 和 421.3464 碎片的四個(gè)經(jīng)驗(yàn)式。用 3.10 ppm 質(zhì) 量 精 度 確 證 了 m/z309.1176 處斷裂的二糖碎片，及 m/z143.1065 處小的呋喃環(huán)碎片（質(zhì)量精度4.90 ppm）。圖 5 中的表格列出了偽人參皂甙所有碎片的測(cè)量質(zhì)量、計(jì)算精度。

與之相比，保留時(shí)間 27.7 分鐘的化合物是人參的特征組分，人參皂甙 Rf。LC/MS分析顯示，該化合物也含有質(zhì)子化的分子離子 m/z 801.5。這是該分子的典型碎片，可用于區(qū)分人參皂甙 F11。MS/MS 分析中，二糖鏈 m/z 325.0 裂解后，連續(xù)丟失4 個(gè)水分子（圖 6）。得到的碎片離子質(zhì)量為 m/z 459.4、441.4、423.4 和 405.4，不同于 F11 分子產(chǎn)物。沒有見到 m/z143.1 碎 片 。為 確 證 鑒 定 結(jié) 果 進(jìn) 行 了LC/MS oaTOF 分析。TOF 圖譜顯示分子離 子 m/z 801.4999， 質(zhì) 量 精 度 為0.16 ppm（圖 7）。以 0.9 到 1.6 ppm 的質(zhì)量 精 度 確 證 了 丟 失 水 后 得 到 的 m/z459.3834、 441.3726、 423.3620 和405.3515 碎片。斷裂的葡萄糖二糖的質(zhì)量在 m/z 325.1134 處以 0.22 ppm 質(zhì)量精度測(cè)定。圖 6 中的表格列出了人參皂