光度定義
分光光度法是在定波長處或定波長范圍內(nèi)光的吸收度，對該物質(zhì)行定性或定量分析。常用的波長范圍為:(1)200~380nm的紫外光區(qū)，(2)380~780nm的可見光區(qū)，(3)2.5~25μm(按波數(shù)計為4000cm<-1>~400cm<-1>)的紅外光區(qū)。所用儀器為紫外分光光度計、可見光分光光度計(或比色計)、紅外分光光度計或原子吸收分光光度計。為保證測量的度和準(zhǔn)確度，所有儀器應(yīng)按照家計量檢定規(guī)程或本附錄規(guī)定，定期行校正檢定。、
儀器組成
分光光度計已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量。
儀器主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲系統(tǒng)組成。
光譜范圍
包括波長范圍為400~760 nm的可見光區(qū)和波長范圍為200~400 nm的紫外光區(qū).不同的光源都有其有的發(fā)射光譜,因此可采用不同的發(fā)光體作為儀器的光源。
鎢燈的發(fā)射光譜:鎢燈光源所發(fā)出的400~760nm波長的光譜光通過三棱鏡折射后,可得到由紅橙,黃綠,藍(lán)靛,紫組成的連續(xù)色譜;該色譜可作為可見光分光光度計的光源。
分光光度計圖片
分光光度計圖片
氫燈(或氘燈)的發(fā)射光譜:氫燈能發(fā)出185~400 nm波長的光譜可作為紫外光光度計的光源。
原理
分光光度計采用個可以產(chǎn)生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生定波長的光源，光線透過測試的樣品后，分光線被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
單色光輻射穿過被測物質(zhì)溶液時，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度(光路長度)成正比，其關(guān)系如下式:
A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc
式中 :A 為吸光度;
I。為入射的單色光強(qiáng)度;
I 為透射的單色光強(qiáng)度;
T 為物質(zhì)的透射率;
k 為摩爾吸收系數(shù);
L 為被分析物質(zhì)的光程，即比色皿的邊長;
c 為物質(zhì)的濃度;
物質(zhì)對光的選擇性吸收波長，以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。當(dāng)已知某純物質(zhì)在定條件下的吸收系數(shù)后可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其吸收度,即可由上式計算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見光區(qū)，除某些物質(zhì)對光有吸收外，很多物質(zhì)本身并沒有吸收但可在定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過處理使其顯色后再測定,故又稱比色分析。由于顯色時影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光純度較差的儀器，故測定時應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌吠瑫r操作。
