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閱讀:249 發(fā)布時(shí)間:2024-7-8
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素主要有引物的選擇與設(shè)計(jì),酶的質(zhì)量。模板的制備,在前二者都穩(wěn)定可行的情況下,PCR模板的制備尤為重要。模板處理方法的選擇及操作人員的基 本技能,決定分離模板核酸(DNA或RNA)的質(zhì)和量及PCR的成敗。而提高模板核酸質(zhì)量的 關(guān)鍵是除去雜質(zhì)(蛋白質(zhì)、酶、脂肪等)。除去抑制Taq DNA聚合酶活性抑制因子,提高模板核酸的產(chǎn)量。
傳統(tǒng)的核酸模板提取方法是采用去垢劑如SDS等來(lái)破壞細(xì)胞組份,溶解細(xì)胞膜,使蛋白質(zhì)變性,再用蛋白酶K來(lái)消化去除蛋白質(zhì),尤其是與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì),再用酚:抽提,然后用乙醇或異丙醇沉淀核酸,供PCR實(shí)驗(yàn)用。但近幾年來(lái)也發(fā)展了些 簡(jiǎn)便實(shí)用較為有效的標(biāo)本消化處理方法。亦可滿足PCR實(shí)驗(yàn)的要求。采用哪種方法消化 處理標(biāo)本,視PCR實(shí)驗(yàn)的目的(是科研還是檢測(cè))及環(huán)境條件而定。
模板核酸的提取制備方法:
一、蛋白酶K消化裂解法:適用于所有標(biāo)本的消化處理,尤以DNA樣品為佳。如組 織細(xì)胞(包括石蠟包埋組織)絨毛、毛發(fā)、精斑、血液(血清、血漿、全血)局部分泌 物、尿,糞便等。
1、試劑配制
1)蛋白酶K消化液:10mmol/L Tris.cl(PH8.0)
10mmol/LEDTA
150mmol/LNaCL
0.5%SDS
100~200ug/ml蛋白酶K.
2)蛋白酶K最好用水配成20mg/ml,臨用時(shí)加入消化液中。
2、提取方法:
有些標(biāo)本、在用蛋白酶K消化前,還需預(yù)處理一下,如糞便、分泌物、痰液、組 織塊、石蠟包埋組織等,其方法有離心去掉雜質(zhì),脫蠟等。
臨床標(biāo)本或經(jīng)預(yù)處理的標(biāo)本加蛋白酶K裂解液50~100ul.混勻,55℃1~3小時(shí), 或37℃過(guò)夜。加等體積的飽和酚抽提1~2次,再加等體積的:(49:1)抽提一 次,上清加入1/10體積的pH值5.23mmol/L醋酸鈉緩沖液,加入2.5倍體積的冰冷無(wú)水 乙醇(或加等體積的異丙醇)-20℃放置至少3h.取出后14000轉(zhuǎn)/min離心15min.小心吸 棄或倒出上清,沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min離心洗滌1~2次,特別小心的 吸棄或倒掉上清,真空或37℃溫箱或室溫干燥,加TE緩沖液20ul.溶解后,取3~8ul 用于PCR擴(kuò)增,或放-20℃保存。
蛋白酶K消化法除上述經(jīng)典處理法外,亦可在蛋白K消化處理標(biāo)本,經(jīng)離心處理 后,吸取上清經(jīng)95~97℃或煮沸10min滅活蛋白酶K后,直接作核酸模板用于PCR擴(kuò)增。 如雜質(zhì)較多,還可經(jīng)酚:抽提后,即可用于PCR反應(yīng)。此法蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)消除 *,Taq酶活性不受影響,具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。但操作繁復(fù),技術(shù)要求高。
二、直接裂解法: 標(biāo)本(組織細(xì)胞,分泌物)加PBS或生理鹽水離心洗滌后,加消化 裂解液20~50ul(0.5%NP-40和0.5%吐溫-20),95~98℃,15~30min以裂解病原體,裂解細(xì)胞。然后12000r/min離心5~10min,取上清20~30ul用于PCR擴(kuò)增。血清標(biāo)本可 直加等體積的消化液,加熱處理離心后PCR擴(kuò)增。亦有用5%的NP-40和1.5%2-ME做裂解 液,95℃30min消化處理,離心取上清,PCR擴(kuò)增檢測(cè)HBV DNA.
三、堿變性法: 取血清20ul,加入1mol/L NaOH 20ul,37℃30min,離心,加 1mol/L HCl 20ul,離心后,取上清5ul,用于PCR擴(kuò)增。*亦有用10ul血清加NaOH至 0.2mol/L,37℃1h,再加HCL中和離心后取上清10ul做PCR,其特異性和敏感性較前法 更好。
四、煮沸法: 經(jīng)離心洗滌過(guò)的組織細(xì)胞,分泌物及血液標(biāo)本,加適量無(wú)菌蒸餾水或PBS,混勻 后,100℃煮沸10~15min,14000r/min 10min,取上清做PCR.
五、碘化鈉法: 取組織細(xì)胞及抗凝血液10~100ul,加等體積的6MNaI,反復(fù)輕混 20s,加等體積:(49:1)振勻后,離心取上清加0.6體積的異丙醇,混勻后 置室溫3min.14000r/min 10min,沉淀加10~100ul,TE溶解,取5~10ul做PCR,亦有 用100ul血清加裂解液300ul(6M NaI,0.5%十二烷基肌酸鈉,10ug糖原,26mmol/L pH8.0 Tris-HCL,13mmol/LEDTA)混勻后,60℃15min,加等體積異丙醇,離心沉定 后,加TE液用于PCR擴(kuò)增,其產(chǎn)量和質(zhì)量較高。
六、異硫氰酸胍法
此法主要用于RNA的提取。標(biāo)本為組織細(xì)胞及血清等。
1、異硫氰酸胍消化液
異硫氰酸胍4mol/L
檸檬酸鈉(PH7.0)25mmol/L
十二烷基肌酸鈉0.5%
β-巰基乙醇0.1mol/L
2、消化方法: 用50~100ul細(xì)胞懸液及血清,加等體積的異硫氰酸胍消化液振混勻 后,或65℃1小時(shí),或室溫放置數(shù)分鐘,然后加1/10體積的3mmol/L pH5.2的醋酸鈉緩 沖液,再加等體積的酚:,用力振搖約10s,10000r/min,離心5min,取上清加等 體積異丙醇-20℃放置3h后,14000r/min離心15min,沉定用75%冰冷乙醇離心洗滌1~ 2次,真空干燥,沉淀用TE緩沖液溶解即可用于逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增,或放-20℃保存。
其它消化處理標(biāo)本提模板核酸的方法有①異硫氰酸胍一二氧化硅法②異硫氰酸胍-玻璃粉法。③Chelex-100法。④全血直接擴(kuò)增法⑤尿素消化裂解法。各有千秋,可根據(jù)情況選用。
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素主要有引物的選擇與設(shè)計(jì),酶的質(zhì)量。模板的制備,在前二者都穩(wěn)定可行的情況下,PCR模板的制備尤為重要。模板處理方法的選擇及操作人員的基 本技能,決定分離模板核酸(DNA或RNA)的質(zhì)和量及PCR的成敗。而提高模板核酸質(zhì)量的 關(guān)鍵是除去雜質(zhì)(蛋白質(zhì)、酶、脂肪等)。除去抑制Taq DNA聚合酶活性抑制因子,提高模板核酸的產(chǎn)量。
傳統(tǒng)的核酸模板提取方法是采用去垢劑如SDS等來(lái)破壞細(xì)胞組份,溶解細(xì)胞膜,使蛋白質(zhì)變性,再用蛋白酶K來(lái)消化去除蛋白質(zhì),尤其是與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì),再用酚:抽提,然后用乙醇或異丙醇沉淀核酸,供PCR實(shí)驗(yàn)用。但近幾年來(lái)也發(fā)展了些 簡(jiǎn)便實(shí)用較為有效的標(biāo)本消化處理方法。亦可滿足PCR實(shí)驗(yàn)的要求。采用哪種方法消化 處理標(biāo)本,視PCR實(shí)驗(yàn)的目的(是科研還是檢測(cè))及環(huán)境條件而定。
模板核酸的提取制備方法:
一、蛋白酶K消化裂解法:適用于所有標(biāo)本的消化處理,尤以DNA樣品為佳。如組 織細(xì)胞(包括石蠟包埋組織)絨毛、毛發(fā)、精斑、血液(血清、血漿、全血)局部分泌 物、尿,糞便等。
1、試劑配制
1)蛋白酶K消化液:10mmol/L Tris.cl(PH8.0)
10mmol/LEDTA
150mmol/LNaCL
0.5%SDS
100~200ug/ml蛋白酶K.
2)蛋白酶K最好用水配成20mg/ml,臨用時(shí)加入消化液中。
2、提取方法:
有些標(biāo)本、在用蛋白酶K消化前,還需預(yù)處理一下,如糞便、分泌物、痰液、組 織塊、石蠟包埋組織等,其方法有離心去掉雜質(zhì),脫蠟等。
臨床標(biāo)本或經(jīng)預(yù)處理的標(biāo)本加蛋白酶K裂解液50~100ul.混勻,55℃1~3小時(shí), 或37℃過(guò)夜。加等體積的飽和酚抽提1~2次,再加等體積的:(49:1)抽提一 次,上清加入1/10體積的pH值5.23mmol/L醋酸鈉緩沖液,加入2.5倍體積的冰冷無(wú)水 乙醇(或加等體積的異丙醇)-20℃放置至少3h.取出后14000轉(zhuǎn)/min離心15min.小心吸 棄或倒出上清,沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min離心洗滌1~2次,特別小心的 吸棄或倒掉上清,真空或37℃溫箱或室溫干燥,加TE緩沖液20ul.溶解后,取3~8ul 用于PCR擴(kuò)增,或放-20℃保存。
蛋白酶K消化法除上述經(jīng)典處理法外,亦可在蛋白K消化處理標(biāo)本,經(jīng)離心處理 后,吸取上清經(jīng)95~97℃或煮沸10min滅活蛋白酶K后,直接作核酸模板用于PCR擴(kuò)增。 如雜質(zhì)較多,還可經(jīng)酚:抽提后,即可用于PCR反應(yīng)。此法蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)消除 *,Taq酶活性不受影響,具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。但操作繁復(fù),技術(shù)要求高。
二、直接裂解法: 標(biāo)本(組織細(xì)胞,分泌物)加PBS或生理鹽水離心洗滌后,加消化 裂解液20~50ul(0.5%NP-40和0.5%吐溫-20),95~98℃,15~30min以裂解病原體,裂解細(xì)胞。然后12000r/min離心5~10min,取上清20~30ul用于PCR擴(kuò)增。血清標(biāo)本可 直加等體積的消化液,加熱處理離心后PCR擴(kuò)增。亦有用5%的NP-40和1.5%2-ME做裂解 液,95℃30min消化處理,離心取上清,PCR擴(kuò)增檢測(cè)HBV DNA.
三、堿變性法: 取血清20ul,加入1mol/L NaOH 20ul,37℃30min,離心,加 1mol/L HCl 20ul,離心后,取上清5ul,用于PCR擴(kuò)增。*亦有用10ul血清加NaOH至 0.2mol/L,37℃1h,再加HCL中和離心后取上清10ul做PCR,其特異性和敏感性較前法 更好。
四、煮沸法: 經(jīng)離心洗滌過(guò)的組織細(xì)胞,分泌物及血液標(biāo)本,加適量無(wú)菌蒸餾水或PBS,混勻 后,100℃煮沸10~15min,14000r/min 10min,取上清做PCR.
五、碘化鈉法: 取組織細(xì)胞及抗凝血液10~100ul,加等體積的6MNaI,反復(fù)輕混 20s,加等體積:(49:1)振勻后,離心取上清加0.6體積的異丙醇,混勻后 置室溫3min.14000r/min 10min,沉淀加10~100ul,TE溶解,取5~10ul做PCR,亦有 用100ul血清加裂解液300ul(6M NaI,0.5%十二烷基肌酸鈉,10ug糖原,26mmol/L pH8.0 Tris-HCL,13mmol/LEDTA)混勻后,60℃15min,加等體積異丙醇,離心沉定 后,加TE液用于PCR擴(kuò)增,其產(chǎn)量和質(zhì)量較高。
六、異硫氰酸胍法
此法主要用于RNA的提取。標(biāo)本為組織細(xì)胞及血清等。
1、異硫氰酸胍消化液
異硫氰酸胍4mol/L
檸檬酸鈉(PH7.0)25mmol/L
十二烷基肌酸鈉0.5%
β-巰基乙醇0.1mol/L
2、消化方法: 用50~100ul細(xì)胞懸液及血清,加等體積的異硫氰酸胍消化液振混勻 后,或65℃1小時(shí),或室溫放置數(shù)分鐘,然后加1/10體積的3mmol/L pH5.2的醋酸鈉緩 沖液,再加等體積的酚:,用力振搖約10s,10000r/min,離心5min,取上清加等 體積異丙醇-20℃放置3h后,14000r/min離心15min,沉定用75%冰冷乙醇離心洗滌1~ 2次,真空干燥,沉淀用TE緩沖液溶解即可用于逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增,或放-20℃保存。
其它消化處理標(biāo)本提模板核酸的方法有①異硫氰酸胍一二氧化硅法②異硫氰酸胍-玻璃粉法。③Chelex-100法。④全血直接擴(kuò)增法⑤尿素消化裂解法。各有千秋,可根據(jù)情況選用。