一個(gè)實(shí)驗(yàn)室得到一個(gè)新的細(xì)胞株后，首先要把該細(xì)胞株培養(yǎng)擴(kuò)增后凍存起來。細(xì)胞凍存首先可以在由于污染等情況丟失細(xì)胞時(shí)有備份可用，另外幾乎所有細(xì)胞在培養(yǎng)傳代的過程中發(fā)生一定程度的變異，為了保持實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致，一般細(xì)胞在培養(yǎng)幾十代以后就不能再使用了，需要將凍存的，傳代較少的細(xì)胞化凍培養(yǎng)再使用。細(xì)胞冷凍過程有四個(gè)要點(diǎn)：細(xì)胞的收獲、保護(hù)劑的使用、冷凍速率和儲(chǔ)存環(huán)境。 

1、 細(xì)胞的收獲

用來凍存的細(xì)胞一般選擇在細(xì)胞約鋪滿 90% 的時(shí)候，這時(shí)細(xì)胞生長狀態(tài)好，細(xì)胞數(shù)量也多，并且在收獲細(xì)胞前 24 小時(shí)換一次培養(yǎng)液。收獲用來凍存的細(xì)胞開始時(shí)方法和平時(shí)一樣，用 100xg 離心 5 分鐘收集細(xì)胞再重懸，活細(xì)胞記數(shù)。稀釋或濃縮到細(xì)胞保存的最終細(xì)胞濃度的二倍(一般是 400-1000 萬 細(xì)胞 /ml )，加入已經(jīng)配好的等體積的培養(yǎng)液保護(hù)劑混合溶液中輕輕混勻，分裝到凍存管，冷凍保存。

 

2、保護(hù)劑的使用

細(xì)胞凍存中， 一般使用DMSO 作為保護(hù)劑。在細(xì)胞凍存中， DMSO 使用的最終濃度一般是 5-15% ，某種具體細(xì)胞的凍存液中的DMSO濃度可以從ATCC查到。對特別敏感的細(xì)胞特別是雜交瘤細(xì)胞在凍存時(shí)使用 95% 血清和 5%DMSO 可能會(huì)好些。保護(hù)劑在使用時(shí)先用培養(yǎng)液或血清配成最終濃度的2倍，再與等體積的懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)液混合。

 

3、細(xì)胞凍存的速率

細(xì)胞的冷凍速率最適控制在讓細(xì)胞有足夠的時(shí)間脫水而又不被過度脫水導(dǎo)致細(xì)胞損害。對大多數(shù)細(xì)胞來說，每分鐘降 1 至 3 ℃是合適的。通常的操作是把細(xì)胞先在-20℃1-2個(gè)小時(shí)，再放入 -80℃冰箱過夜(如果沒有-80℃冰箱，可以用干冰替代)，再轉(zhuǎn)入液氮罐或低于 -130℃的冰箱長期保存。

 

4、儲(chǔ)存環(huán)境

細(xì)胞長期保存溫度是 -130 ℃或更低。液氮罐中氣態(tài)層溫度在 -140℃至 -180℃之間，細(xì)胞可保存在氣態(tài)層或浸入液氮中，如果可能最好保存在氣態(tài)層，因?yàn)檫@樣可避免由于有液氮進(jìn)入凍存管而在拿出細(xì)胞時(shí)引起爆炸(但是這樣液氮罐內(nèi)只能存儲(chǔ)少量液氮，需要經(jīng)常添加)。細(xì)胞也可以在-80℃冰箱保存幾個(gè)月左右的時(shí)間。

 

注意事項(xiàng)：

1. 細(xì)胞凍存原則為“慢凍"，即讓細(xì)胞在緩慢降溫的條件下逐漸冷凍。當(dāng)細(xì)胞快速冷凍時(shí)，水和離子往往會(huì)留在細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成會(huì)撕裂和刺穿細(xì)胞膜。相反，如果細(xì)胞冷凍太過緩慢，則細(xì)胞外的水會(huì)在細(xì)胞內(nèi)冰形成之前結(jié)冰。這允許水通過滲透作用逸出，但增加了可能有毒的細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的濃度。因此對于大多數(shù)細(xì)胞，最佳冷凍速率在每分鐘1℃之間。

2. DMSO能夠快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中，延緩溫度下降速度，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用。

3. 凍存可用10%～90%的血清，一般高濃度血清有助于維護(hù)細(xì)胞活力，此處介紹20%終濃度有利于細(xì)胞懸浮而少沉積(4℃時(shí))，復(fù)蘇存活率在80%～90%，對原代培養(yǎng)細(xì)胞，以90%血清凍存更為有效。

4. 細(xì)胞離心后盡量吸干凈上清液，減少培養(yǎng)基殘留，避免稀釋凍存液。

5. DMSO溶于培養(yǎng)基時(shí)，將釋放大量熱量，所以細(xì)胞凍存液需提前配制，冷卻后再使用，不能直接將DMSO加入含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中，避免燙傷細(xì)胞。

6. 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇過程中，不可避免會(huì)損失部分細(xì)胞，所以凍存的密度不能太低。推薦密度為300-500w/mL。

7. 細(xì)胞懸液加入凍存液以后盡量短時(shí)間的在常溫放置，DMSO常溫下對細(xì)胞損傷大，分裝完成后立即轉(zhuǎn)入程序降溫盒。